溫茹淑，曾德莉，方展強

(1．嘉應(yīng)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東梅州514015;2．華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室，廣東廣州510631)

劍尾魚(Xiphophorus helleri)，別名劍魚、青劍，英文名 Swordtail．隸屬于鳉形目，花鳉科(Poeciliidae)，胎鳉屬．原產(chǎn)地墨西哥、危地馬拉，是一種熱帶觀賞魚類，其體型小，繁殖周期短，易飼養(yǎng)．其被開發(fā)作為水環(huán)境污染“活檢測器”的理想實驗魚，在水生態(tài)毒理學(xué)研究中的應(yīng)用亦逐步展開［1］．

關(guān)于硬骨魚類精巢組織學(xué)和形態(tài)學(xué)的研究已有較多的報道［2-3］，多集中在卵生、體外受精類型的硬骨魚類．對卵胎生、體內(nèi)受精魚類的研究則較少［3］．劍尾魚屬卵胎生，體內(nèi)受精魚類，其鰓、肝臟和腎臟的組織結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)已有研究報道［3-6］，尚未見有關(guān)其精巢組織結(jié)構(gòu)研究的報道．本研究通過對雄性劍尾魚精巢的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)等方面的研究，以期對劍尾魚的繁殖生物學(xué)提供基礎(chǔ)資料，為進一步調(diào)控魚類的生殖活動，提高魚類的繁殖性能和生產(chǎn)水平，為劍尾魚的實驗動物化提供基礎(chǔ)理論．

1 材料與方法

1．1 實驗用魚

實驗用的劍尾魚(Xiphophorus helleri)于2009年6月取自珠江水產(chǎn)研究所，為同批孵化的性成熟雄性個體，體長為6．35 ±0．5 cm，體質(zhì)量為1．6 ±0．6 g．

1．2 形態(tài)學(xué)觀察

將麻醉的劍尾魚置于解剖盤中，解剖觀察精巢和卵巢的外形特征，對其形態(tài)特征進行描述并拍照．然后將其保存在體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0．65%NaCl)中，以備觀察．

1．3 組織學(xué)觀察

活體取精巢進行常規(guī)石蠟切片，用Bouin氏液固定24 h，經(jīng)各級乙醇沖洗、脫水，經(jīng)二甲苯透明，54～56℃石蠟包埋，制成5～7μm切片，H—E染色，中性樹膠封片．置Olympus BX45-32P02顯微鏡進行顯微觀察，用尼康數(shù)碼相機進行拍照．

1．4 超微結(jié)構(gòu)觀察

部分精巢樣品經(jīng)0．2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7．4)漂洗，投入體積分?jǐn)?shù)4%的戊二醛低溫固定15 h，后置體積分?jǐn)?shù)1%的鋨酸固定3h，逐級乙醇脫水，環(huán)氧丙烷透明，Epon812包埋，切成40～60 nm超薄切片，醋酸雙氧鈾及Reynold檸檬酸鉛復(fù)染，置日立H-300型透射電鏡觀察及拍照．

2 結(jié)果與分析

2．1 精巢的外部形態(tài)

劍尾魚屬卵胎生魚類，70 d齡左右出現(xiàn)雄性性征，即尾鰭出現(xiàn)劍尾，雄魚具生殖足(由臀鰭演變而來)．在解剖鏡下觀察發(fā)現(xiàn)雄性劍尾魚腹腔有劍尾魚精巢1對，約0．8 cm，呈乳白色．位于腹腔背側(cè)，消化道背面，腎臟腹面．左右精巢(T)緊密排列，呈2條索狀結(jié)構(gòu)，左右精巢前端游離于腹腔，在中部開始匯合成1條輸精管(VD)，開口于由臀鰭形成的生殖足．精巢其橫切面呈卵圓形，左右精巢大小略有差異，精巢外被一層結(jié)締組織膜，表面光滑，有背腹之分，背部拱起，腹部較平坦，腹面有一縱向凹陷，其中有血管分布(圖版1)．

2．2 精巢的組織結(jié)構(gòu)

劍尾魚精巢的橫切面呈卵圓形，內(nèi)部充滿了精小囊(SC)，精子發(fā)育的全過程在精小囊內(nèi)進行(圖版2)．劍尾魚精子的發(fā)育過程歷經(jīng)初級精原細胞、次級精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞、成熟精子和精子束．在同一精小囊中，精子的發(fā)育基本同步，但在不同精小囊中生殖細胞的發(fā)育不一致．生殖季節(jié)有不同發(fā)育階段生精細胞構(gòu)成的精小囊(圖版3)．在光鏡下觀察成熟雄魚的精巢切片，可見處于不同發(fā)育階段的精細胞．

精原細胞是生精細胞中體積最大的細胞，在精巢中可見到2種類型的精原細胞，包括初級精原細胞(SG1)和次級精原細胞(SG2)．

初級精原細胞 細胞體積大，緊貼生殖上皮，常1～3個分散存在，呈圓形、橢圓形或梭形，核橢圓形，居中或偏于一側(cè)，核膜清晰，細胞質(zhì)幾乎不染色，可見到被染成淡紅色的細胞膜(圖版4)．

次級精原細胞 靠近生殖上皮，細胞呈圓形或橢圓形，核圓形，核膜較初級精原細胞模糊，細胞質(zhì)染色也較淡，常幾個聚集在一起外包以極薄的結(jié)締組織膜組成一個較小的精小囊(圖版5)．

初級精母細胞 精小囊體積明顯增大，初級精母細胞(SC1)體積比初級精原細胞小，細胞呈圓形，核仁消失，細胞核圓形或橢圓形，可看見細胞核內(nèi)染色較深的染色體，核周圍間隙呈囊泡狀(圖版6)．

次級精母細胞 精小囊的體積達到最大，次級精母細胞(SC2)體積略小于初級精母細胞，細胞與細胞之間界限清楚，細胞多為圓形，細胞核位于一側(cè)，呈圓形或略橢圓形，核膜較清晰(圖版7)．

精子細胞 精子細胞(ST)小于次級精母細胞，是各期生精細胞中體積最小的生殖細胞，精子細胞中細胞核占細胞體積的絕大部分，核物質(zhì)濃縮，細胞質(zhì)減少(圖版8)．精子細胞不再分裂．它要經(jīng)過精子形成過程才能成為有功能的精子．

成熟精子 成熟精子(SP)頭部呈橢圓形，并形成細長的鞭毛(圖版9)．精子鞭毛為典型的9+2結(jié)構(gòu)，中間為軸絲．

精子束 精子呈放射狀整齊排列于精小囊內(nèi)，頭部(↓)指向囊壁，尾部(↓)指向精小囊中央腔(圖版10)．

精小管內(nèi)有許多精小囊，精小囊按照精子的發(fā)育階段呈規(guī)律分布(圖版11，12)．從同一切面可看出，發(fā)育早期(↓)的細胞往往處于精巢的外圍，而發(fā)育晚期(↓)的細胞往往處于精巢的中間部位．因此可推斷，從精子發(fā)生到成熟精子的形成，精小囊是逐漸向中央腔方向移動，在遷移過程中逐漸發(fā)育的，在精子成熟過程中，精小囊慢慢演變成包裹成熟精子的精包．最后精子以精包為單位被釋放到與輸精管相連接的輸精管中央腔(↓)中(圖版13)．待精子完全成熟后，精包破裂．精子被釋放出來，并通過輸出管排出體外．由此可說明，劍尾魚的精巢屬于小管型精巢．

2．3 精子發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)

劍尾魚的精細胞(↓)經(jīng)過發(fā)育變態(tài)后成為形態(tài)復(fù)雜的成熟精子(圖版14)，精巢內(nèi)成熟精子呈放射狀整齊而又緊密排列于精小囊內(nèi)，頭部朝向管壁支持細胞，并埋于支持細胞中，尾部朝向精小囊中央腔，并呈多層排列(圖版15)．劍尾魚的精子分為頭部、中段、尾部3個部分，成熟精子的頭部細長，呈橢圓形，只有1個由核蛋白組成染色質(zhì)致密的核，其外有1層質(zhì)膜，精子前端沒有頂體，后端有一較淺的植入窩;中段緊接精子頭部，直徑較精子頭部略大，線粒體多，其軸絲為典型的“9+2”結(jié)構(gòu)(圖版16);尾部的軸絲的橫切面也是典型的“9+2”雙聯(lián)管結(jié)構(gòu)，軸絲外包繞著線粒體鞘，外側(cè)由1層鞘膜包圍，末段軸絲裸露(圖版17)．

3 討論

3．1 劍尾魚精巢形態(tài)結(jié)構(gòu)的特點

硬骨魚類的成熟精巢體積一般較小，大多呈長囊狀，且成對存在，僅件黃鱔(Monopterus albus)的除外，其精巢單一，位于身體右側(cè)，為長圓柱形［7］．一般硬骨魚類的精巢在尾端合并，呈“Y”型．但一些魚類，如烏鱧(Ophicephalus argus)［8］、金色小沙丁魚(sardineUa aurita)［9］精巢在后端并不合并，而是分別開口于泄殖腔．本文觀察到成熟劍尾魚的精巢呈2條緊密排列的索狀結(jié)構(gòu)，精巢中部匯合成一較短的輸精管，開口于由臀鰭形成的生殖足，但精巢在外觀上并不成“Y”型．同屬于硬骨魚的褐菖鮋(Sebastiscus marmoratus)［3］、孔 雀 魚 (Poecilia reticulata)［10］，其精巢分別呈梭形和腎形，在精巢的末端有左右2條輸精管平行排列，并向魚體后端延伸，最后2條輸精管匯合，經(jīng)泄殖孔開口于體外．由此可見，在卵胎生魚類中，其精巢的形態(tài)和結(jié)構(gòu)也存在顯著差異．而鲇形目魚類如長吻鮠(Leiocassis longirostris Gianther)［2］、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco Richardson)［10］等精巢往往分支，黃顙魚精巢每側(cè)向外伸出約26個葉狀分支，葉狀分支基部寬扁，向末端逐漸變細，貯精囊由左右側(cè)生精部在近腎臟末端處合并，形成輸精管，在輸精管兩側(cè)也伸出約14對細長的指狀分支．而長吻鮠［11］精巢分支更典型，精巢高度分支呈指狀，分支之上還有分支．而鲇形目的革胡子鲇(Clarias leather)等魚的精巢形態(tài)則僅精巢外側(cè)緣有少量較短的齒狀突起［12］．

圖版 劍尾魚精巢的顯微和超微結(jié)構(gòu)

3．2 劍尾魚精巢類型的劃分

關(guān)于硬骨魚類精巢類型的劃分，一般根據(jù)各級生精細胞在精巢內(nèi)分布的特點而分為小葉型和小管型兩種．二者的主要區(qū)別在于葉型精巢的精原細胞存在于小葉的邊緣處，隨著發(fā)育的進行，精原細胞和精母細胞形成小囊腔隙，精子細胞和精子逐漸向小囊腔的中央移動，其成熟精子存在于小葉腔和輸精小管內(nèi)．管型精巢的精原細胞只分布在小管的盲端，隨著發(fā)育，精子細胞和精子逐漸向輸出管移動，其成熟精子只存在于靠近輸精小管的部位．

本實驗對劍尾魚精巢組織的研究表明，在精小管橫切面上存在一種生精細胞，并且從同一切面可看出，發(fā)育早期的細胞往往處于精巢的外圍，而發(fā)育晚期的細胞往往處于精巢的中間部位，從背側(cè)到腹側(cè)依次為精原細胞、精母細胞、精子細胞和成熟精子，從精子發(fā)生到成熟精子的形成，精小囊逐漸向中央腔方向移動，逐漸發(fā)育，最后成熟精子被釋放到與輸精管相連接的輸精管中央腔中，并通過輸精管排出體外．故認為劍尾魚精巢屬于管型結(jié)構(gòu)．大多數(shù)硬骨魚類的精巢為葉型精巢，屬管型精巢的魚類很少．

3．3 精子發(fā)生和形成的特點

劍尾魚精子的發(fā)生有如下特點:

(1)同大多數(shù)硬骨魚類一樣，劍尾魚精巢內(nèi)存在2種類型的精原細胞，即初級精母細胞和次級精母細胞或稱之為A型精原細胞和B型精原細胞［13］．兩者的主要差異表現(xiàn)在核的形態(tài)和位置，核質(zhì)的染色程度以及細胞是否存在于精小囊中．對于魚類的精原細胞，大多數(shù)學(xué)者認為有2種類型，在性成熟的雄魚精巢中初級精原細胞是一種干細胞，只能進行有絲分裂，以維持精巢內(nèi)精原細胞數(shù)量．

(2)在初級精母細胞分裂分化成精子的過程中，細胞體積逐漸變小，核染色質(zhì)不斷地濃縮，細胞形態(tài)也由不規(guī)則變成橢圓形或者圓形，核膜質(zhì)膜由模糊逐漸變得清晰．

(3)在劍尾魚精子的形成過程中，細胞核濃縮以后鞭毛才形成，這與長吻鮠的相似．

(4)在精子成熟的末期精子呈放射狀整齊排列于精小囊內(nèi)，頭部指向囊壁，尾部指向精小囊中央腔．這種現(xiàn)象同樣出現(xiàn)在隸屬于鳉形目同為卵胎生的孔雀魚［9］和食蚊魚［11］精子發(fā)生過程中．此現(xiàn)象的生物學(xué)意義待進一步探討．

(5)劍尾魚精子頭部細長，尾部中段有發(fā)達的線粒體鞘，表明精子細微結(jié)構(gòu)是適應(yīng)卵胎生發(fā)育演化的結(jié)果，精子頭部沒有項體，說明卵胎生魚類的精子是介于卵生魚類和胎生動物之間的中間類型［9］．

3．4 體內(nèi)受精方式

研究表明，劍尾魚有交配器，生殖孔開在臀鰭基部的前面．

［1］溫茹淑，方展強，陳庭偉．17β-雌二醇對雄性唐魚卵黃蛋白原誘導(dǎo)及性腺發(fā)育的影響［J］．動物學(xué)研究，2008，29(1):43-48．

［2］張耀光，羅泉笙，鐘明超．長吻鮠精巢發(fā)育的分期及精子的發(fā)生和形成［J］．動物學(xué)研究，1992:13(3):281-287．

［3］江寰新，尤永隆，林丹軍，等．中華烏塘鱧魚精巢的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察［J］．福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2004，33(1):89-93

［4］方展強，邱玫，王春鳳．劍尾魚鰓的光鏡、掃描和透射電鏡觀察［J］．電子顯微學(xué)報，2004，23(5):553-559．

［5］方展強，林敏朝．劍尾魚肝臟的顯微和超微結(jié)構(gòu)［J］．電子顯微學(xué)報，2006，24(3):265-270．

［6］林國輝，邱玫，方展強．劍尾魚腎臟組織的超微結(jié)構(gòu)觀察［J］．華南師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2011(1):105-108．

［7］張小雪．黃鱔精巢顯微和超微結(jié)構(gòu)的研究［J］．水利漁業(yè)，1994(4):9-14．

［8］馮俊榮．烏鱧精巢發(fā)育的研究［J］．水利漁業(yè)，1995，(5):7-9．

［9］郭明申，劉龍，穆淑梅，等．孔雀魚精子發(fā)生的顯微與超微結(jié)構(gòu)［J］．河北大學(xué)學(xué)報，2006，26(6):653-658．

［10］劉文斌．黃顙魚精巢發(fā)育和周年變化及精子的發(fā)生與形成［J］．湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2004，27(1):66-70．

［11］劉灼見，高書堂，鄧青．食蚊魚的性腺發(fā)育及性周期研究［J］．武漢大學(xué)學(xué)報，1996，42(4):487-490．

［12］DODD JM，HOARW S，RANDALLD J，etal．Reproduction in cartilaginous fishes(Chondrichthyes):Fish Physiology，Vol IXA:Reproduction［M］．New York:Academic Press，1983:58-59．

［13］張旭晨，王所安．細鱗魚精巢超微結(jié)構(gòu)和精子發(fā)生［J］．動物學(xué)報，1992，38(4):355-358．