［摘 要］ 目的：探討硫唑嘌呤（AZA）對還原型谷胱甘肽（GSH）過氧化物酶4抑制劑RSL3誘導的小鼠精母細胞鐵死亡的影響，并闡明其可能的作用機制。方法：小鼠精母GC-2細胞隨機分為對照組（不進行處理）、RSL3 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h）、RSL3+鐵死亡抑制劑（Fer-1） 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+2 μmol·L-1 Fer-1 處理12 h）、RSL3+低劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1RSL3 處理24 h+5 μmol·L-1 AZA 處理12 h）、RSL3+ 中劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1 RSL3處理24 h+10 μmol·L-1 AZA 處理12 h） 和RSL3+高劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+20 μmol·L-1 AZA 處理12 h）。MTT 法檢測不同濃度AZA 和不同濃度RSL3 作用后GC-2 細胞活性，采用GSH 和氧化型谷胱甘肽（GSSG） 檢測試劑盒檢測GC-2 細胞中GSH 和GSSG 水平，采用丙二醛（MDA） 試劑盒檢測各組GC-2 細胞中MDA 水平，采用Western blotting 法檢測各組GC-2 細胞中長鏈脂酰CoA 合成酶4 （ACSL4）、血紅素氧合酶1 （HO-1） 和谷胱甘肽過氧化物酶4 （GPX4） 蛋白表達水平，采用免疫熒光法檢測各組GC-2細胞中ACSL4蛋白表達情況。結(jié)果：與對照組比較，5、10和20 μmol·L-1AZA 組GC-2 細胞活性差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05），30 和40 μmol·L-1 AZA 組GC-2 細胞細胞活力明顯降低（Plt;0. 01），因此AZA 作用濃度選擇為20 μmol·L-1以內(nèi)。與對照組比較，1、5 和10 nmol·L-1 RSL3 組GC-2 細胞活性差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05），50、100、500 和1 000 nmol·L-1RSL3 組GC-2 細胞活性明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），因此將RSL3 作用濃度定為10 nmol·L-1 以內(nèi)。GSH 和MDA 試劑盒檢測，與對照組比較， RSL3 組GC-2 細胞中GSSG 和MDA 水平明顯升高（Plt;0. 05）， GSH 水平明顯降低（Plt;0. 05）； 與RSL3 組比較， RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組GC-2 細胞中GSSG 和MDA 水平明顯降低（Plt;0. 01）， GSH 水平明顯升高（Plt;0. 01）。Westernblotting 法檢測， 與對照組比較， RSL3 組GC-2 細胞中ACSL4 和HO-1 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05），GPX4蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01）；與RSL3 組比較，RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組GC-2 細胞中GPX4 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05），ACSL4 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01）。免疫熒光檢測，與對照組比較，RSL3 組GC-2 細胞中ACSL4 蛋白表達量明顯增多；與RSL3組比較，RSL3+Fer-1組和RSL3+AZA組ACSL4蛋白表達量明顯降低。結(jié)論：AZA可以減輕RSL3誘導的小鼠精母細胞鐵死亡。

［關(guān)鍵詞］ 硫唑嘌呤； 鐵死亡； 精母細胞； 谷胱甘肽過氧化物酶4； 酯酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4

［中圖分類號］ R332； R285. 5 ［文獻標志碼］ A[文章編號] 1671?587X（2024）05?1217?10

男性不育是現(xiàn)代社會一大醫(yī)療挑戰(zhàn)，其病因繁多，包括但不限于精液質(zhì)量異常、精子生成過程障礙和精子與卵子結(jié)合障礙等。質(zhì)量良好的精子對于生殖成功至關(guān)重要［1-2］。研究［3-5］ 顯示： 精子在遭受氧化應激損傷時，其動力學特性受到負面影響，表現(xiàn)為活力下降和畸形率升高，上述變化往往導致男性不育。鐵死亡是一種由氧化應激引起的細胞死亡模式， 其特征是還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH） 枯竭和谷胱甘肽過氧化物酶4 （glutathioneperoxidase 4，GPX4） 活性降低，導致身體無法有效清除脂質(zhì)過氧自由基，從而觸發(fā)含鐵生物分子氧化，終致細胞死亡［6-7］。GPX4 抑制劑RSL3 可誘導細胞鐵死亡，在許多研究［8］ 中用作鐵死亡誘導劑。硫唑嘌呤（azathioprine，AZA） 是臨床上廣泛應用的免疫抑制藥物，在體內(nèi)代謝成巰嘌呤發(fā)揮免疫抑制效果，能緩解炎癥反應和減輕氧化應激［9-10］。目前AZA 是否具有調(diào)節(jié)細胞鐵死亡的潛力，尤其在改善男性不育方面的作用尚不明確。本研究旨在探討AZA 能否減輕RSL3 誘導的精母細胞的鐵死亡效應， 闡明AZA 治療男性不育的潛在作用機制，為尋找治療男性不育的新策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器 小鼠精母 GC-2細胞購自美國典型培養(yǎng)物收藏中心（American TypeCulture Collection，ATCC）。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， GPX4、酯酰輔酶A 合成酶長鏈家族成員4 （acyl CoAsynthetase long-chain family member 4， ACSL4）、血紅素氧合酶1 （heme oxygenase-1 ， HO-1）和β 微管蛋白（β-tubulin） 均購自美國Proteintech公司， GSH 和氧化型谷胱甘肽（glutathioneoxidized，GSSG） 檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自蘭杰柯科技有限公司， BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司，抗熒光淬滅劑購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司， 山羊抗兔紅色熒光二抗購自美國Jackson ImmunoResearch 公司， 4'， 6-二脒基-2-苯基吲哚（4'， 6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Centrifuge5804R 高速冷凍離心機購自德國Eppendorf 公司，F(xiàn)luor Chem HD2 化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Protein Simple 公司， Synergy H1 多功能酶熒光標儀購自美國BioTek 公司， NIS-Elements 激光共聚焦顯微鏡購自日本尼康株式會社。

1. 2 小鼠精母 GC-2細胞分組和培養(yǎng)方法 小鼠GC-2 細胞采用含10% 胎牛血清和青-鏈霉素的達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eaglemedium，DMEM），置于37 ℃、5% CO2 的恒溫細胞孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的GC-2 細胞接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中，24 h 后觀察細胞形態(tài)表現(xiàn)，隨機分為對照組（不進行處理）、RSL3 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h）、RSL3+鐵死亡抑制劑（Ferrostatin-1， Fer-1） 組（給予10 nmol·L-1RSL3 處理24 h +2 μmol·L-1 Fer-1 處理12 h）、RSL3+低劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+5 μmol·L-1 AZA 處理12 h）、RSL3+中劑量AZA 組（給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+10 μmol·L-1 AZA 處理12 h） 和RSL3+ 高劑量AZA 組（ 給予10 nmol·L-1 RSL3 處理24 h+20 μmol·L-1 AZA 處理12 h）。

1. 3 MTT 法 檢 測 不 同 濃 度 AZA 作 用 后 各 組GC-2 細胞活性 取對數(shù)生長期GC-2細胞，以每孔5×104 個的密度接種至24 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔加入500 μL DMEM， 置于恒溫孵箱培育24 h。細胞分為對照組和不同濃度AZA 組， 吸棄細胞上清，加入含不同濃度AZA 的培養(yǎng)基，使AZA 終濃度達到0、5、10、20、30 和40 μmol·L-1。12 h 后向24 孔細胞培養(yǎng)板每孔中加入5 g·L-1 MTT 溶液50 μL，置于恒溫孵箱中孵育4 h，輕輕吸棄細胞培養(yǎng)上清， 每孔加入400 μL 二甲亞砜（dimethylsulfoxide， DMSO） 溶液， 將24 孔細胞培養(yǎng)板置于搖床避光振蕩10 min， 采用酶標儀檢測各孔在570 和630 nm 波長處的吸光度（A） 值。細胞活性=（實驗組A 值－空白組A 值） / （對照組A 值－空白組A 值） ×100%。

1. 4 MTT 法檢測不同濃度 RSL3 作用后 GC-2細胞活性 取對數(shù)生長期 GC-2細胞，以每孔 5×104 個的密度接種至 24 孔細胞培養(yǎng)板， 每孔加入500 μL DMEM， 置于恒溫孵箱培育24 h。細胞對照組和不同濃度RSL3 組，吸棄培養(yǎng)上清后，向各組細胞中分別加入含不同濃度RSL3 （0、1、5、10、500 和1 000 nmol·L-1） 的DMEM。MTT 法檢測見“1. 3”。

1. 5 各組GC-2細胞中蛋白含量檢測 取對數(shù)生長期GC-2 細胞，以每孔4×105 個細胞的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中， 按照“1. 2” 中方法分為對照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組。采用1 mL 預冷的磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffer saline，PBS） 洗滌細胞3 次，離心5 min 后收集細胞沉淀。加入50 μL 蛋白去除劑，振蕩重懸細胞， 將重懸的細胞在超低溫液氮和37 ℃水浴條件下反復凍融3 次。置于冰上5 min 后，離心10 min，取樣品上清用于GSH 和GSSG 含量檢測。另取部分上清加入1×GSH 清除緩沖液和1×GSH 清除工作液震蕩混勻，用于GSSG 含量檢測。樣品加入總谷胱甘肽檢測工作液混勻，室溫孵育5 min，加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（triphosphopyridinenucleotide，NADPH） 溶液50 μL 混勻， 25 min 后采用酶標儀檢測412 nm 波長處A 值。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic cacid，BCA） 法檢測各組細胞中目的蛋白含量， 根據(jù)標準曲線計算總谷胱甘肽（即GSH+GSSG） 和GSSG 含量。GSH 含量=（總谷胱甘肽含量-GSSG 含量） ×2。

1. 6 各組GC-2細胞中MDA水平檢測 取對數(shù)生長期GC-2 細胞， 以每孔4×105 個的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板，按照“1. 2”中方法分為對照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組。吸棄培養(yǎng)上清， 采用預冷的PBS 緩沖液輕輕洗滌細胞3 次， 吸棄PBS 緩沖液， 每孔加入200 μL 裂解液， 將樣品置于冰上搖床振蕩裂解30 min， 采用BCA 試劑盒檢測樣品的蛋白濃度；取100 μL 充分裂解的樣品加入200 μL MDA 檢測工作液后充分振蕩混勻。將混合均勻的樣品置于100 ℃ 沸水浴中加熱 15 min， 水浴冷卻至室溫后， 離心10 min取上清液， 采用酶標儀在532 nm 波長處測定各孔A 值， 根據(jù)標準曲線計算各組GC-2 細胞中MDA水平。

1. 7 Western blotting 法 檢 測 各 組 GC-2 細 胞 中GPX4、ACLS4 和 HO-1 蛋白表達水平 取對數(shù)生長期GC-2 細胞，以每孔4×105 個的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中， 按照“1. 2” 中方法分為對照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組， 每孔加入200 μL 裂解液， 將樣品置于冰上充分裂解30 min，4 ℃、12 000 g 離心15 min，取樣本上清，采用BCA 法測定蛋白表達水平。采用12. 5% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDSPAGE）凝膠電泳分離蛋白，于冰水中轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF） 膜。將PVDF膜置于5% 脫脂奶粉中封閉1 h，室溫孵育ACSL4、GPX4、HO-1 和β - 微管蛋白抗體2 h。Westernblotting 洗脫緩沖液（Tris-buffered saline andTween 20， TBST） 洗膜3 次后加入相應二抗，37 ℃孵育1 h， TBST 洗膜3 次， 采用化學發(fā)光底物（electrochemiluminescence， ECL） 顯影液顯影。采用Image J 軟件檢測蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達水平= 目標蛋白條帶灰度值/β-tubulin 蛋白條帶灰度值。

1. 8 免疫熒光法檢測各組 GC-2細胞中 ACSL4蛋白表達量 取對數(shù)生長期 GC-2細胞，以每孔 1×105 個的密度接種于提前放置爬片的6 孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜， 按照“1. 2” 中方法分為對照組、RSL3 組、RSL3+Fer-1 組和RSL3+AZA 組。吸棄上清，每孔采用1 mL 預冷的PBS 緩沖液洗滌細胞3 次。吸棄PBS 緩沖液，每孔加入4% 多聚甲醛1 mL， 固定30 min 后采用真空吸液泵吸棄多聚甲醛。采用0. 5% Triton-X 100 通透10 min， PBS 緩沖液洗滌3 次， 每次5 min。在爬片上滴加免疫封閉液， 室溫封閉1 h， 吸棄封閉液， 將配置好的ACSL4 一抗工作液滴加至染色區(qū)域， 置于濕盒中4 ℃ 過夜。次日回收一抗， PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。避光加入相應熒光二抗，置于濕盒中室溫孵育1 h。吸棄二抗， PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。加入DAPI 孵育10 min， PBS 緩沖液洗滌3 次。加入抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下觀察熒光強度，定性檢測細胞中ACSL4 蛋白表達量。

1. 9 統(tǒng)計學分析 采用 GraphPad Prism 8統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組GC-2 細胞活性， 各組GC-2 細胞中GSH、GSSG 和MDA 水平， 各組GC-2 細胞中GPX4、ACSL4、HO-1 和ACSL4 蛋白表達水平以x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2. 1 不同濃度 AZA 處理后各組 GC-2 細胞活性 與對照組比較， 5、10 和20 μmol·L-1AZA 組GC-2 細胞活性差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05），30 和40 μmol·L-1 AZA 組GC-2 細胞活性明顯降低（Plt;0. 01）。見表1。因此，本研究中AZA 作用濃度選擇為20 μmol·L-1以內(nèi)。

2. 2 不同濃度 RSL3 處理后各組 GC-2 細胞活性 與對照組比較， 1、5 和10 nmol·L-1 RSL3 組細胞活性差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0. 05）， 50、100、500 和1 000 nmol·L-1 RSL3 組細胞活性明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見表2。因此， 本研究將RSL3 作用濃度定為10 nmol·L-1以內(nèi)。

2. 3 各組 GC-2細胞中 GSH 和 GSSG水平 與對照組比較， RSL3 組GC-2 細胞中GSH 水平降低（Plt;0. 05）， GSSG 水平升高（Plt;0. 05）， GSH/GSSG 比值降低（Plt;0. 05）； 與RSL3 組比較，RSL3+AZA 組GC-2 細胞中GSH 水平升高（Plt;0. 01），GSSG 水平降低（Plt;0. 01），GSH/GSSG比值升高（Plt;0. 05）。見表3。

2. 4 各組 GC-2 細胞中 MDA 水平 與對照組比較， RSL3 組GC-2 細胞中MDA 水平升高（Plt;0. 05）； 與RSL3 組比較， RSL3+Fer-1 組和RSL3+不同濃度AZA 組GC-2 細胞中MDA 水平降低（Plt;0. 01）。見表4。

2. 5 各 組 GC-2 細 胞 中 GPX4、 ACLS4 和 HO-1蛋白表達水平 與對照組比較，RSL3組GC-2細胞中ACSL4和HO-1蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05或Plt;0. 01），GPX4 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 05）； 與 RSL3 組 比 較， RSL3+Fer-1 組 和RSL3+ 不同濃度AZA 組GC-2 細胞中ACSL4 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 05 或Plt;0. 01），GPX4 蛋白表達水平明顯升高（Plt;0. 05）。見圖1 和表5。

2. 6 各組 GC-2細胞中 ACSL4蛋白表達量 與對照組比較，RSL3 組GC-2 細胞中ACSL4 蛋白表達量 增 多； 與 RSL3 組 比 較， RSL3+Fer-1 組 和RSL3+AZA 組GC-2 細胞中ACSL4 蛋白表達量明顯降低。見圖2。

3 討 論

男性不育問題在全球范圍內(nèi)逐年加劇，對個人和家庭健康構(gòu)成了嚴峻挑戰(zhàn)。不育癥的成因多樣，包括遺傳、環(huán)境和生活習慣等［11-13］。在臨床上，精子的數(shù)量、活動力和形態(tài)是評估男性不育的關(guān)鍵生物學指標［11-13］。精子的生成和成熟是一個復雜的過程： 精原細胞的增殖并分化為精母細胞， 精母細胞經(jīng)過2 次減數(shù)分裂形成精子細胞， 最后經(jīng)過細胞變態(tài)的過程形成成熟的精子。該過程需要細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和精確的分子調(diào)控，任何對上述過程的干擾都可能導致精子質(zhì)量下降，進而影響男性的生育能力［14-15］。研究 ［16］ 顯示：精母細胞異常，包括染色體異常、染色體非整倍體、DNA 損傷、基因突變、細胞增殖和細胞凋亡的異常等都可能導致精子發(fā)育過程受損。因此，本研究采用GC-2 細胞作為模型， 探討精母細胞異常對于男性不育防治的意義。

鐵死亡是細胞死亡的一種新形式，與男性不育有密切關(guān)聯(lián)［17-18］。鐵死亡是由脂質(zhì)過氧化引發(fā)的細胞死亡途徑，在精子形成中起重要調(diào)控作用。異常鐵死亡過程可能導致睪丸組織和精子的氧化應激，進而影響精子的形成和成熟［19］。研究 ［20］ 顯示：PM2. 5 等導致的男性生殖系統(tǒng)損傷與精母細胞鐵死亡有密切關(guān)聯(lián)。鐵死亡誘導劑包括以下幾類：抑制Xc 系統(tǒng)活性， 如erastin 和柳氮磺砒啶； 抑制或降解GPX4， 如RSL3 和FIN56； 消耗輔酶Q10，如他汀類藥物；通過鐵過載或多不飽和脂肪酸過載誘導脂質(zhì)過氧化，如血紅素及FINO2［21］。本研究中， 鐵死亡誘導劑RSL3 作用GC-2 細胞24 h 后，細胞中GSH 水平降低，MDA 水平升高，鐵死亡標志分子GPX4 表達水平降低，ACSL4 和HO-1 蛋白表達水平升高， 表明RSL3 可以誘導GC-2 細胞發(fā)生鐵死亡。GC-2 細胞經(jīng)鐵死亡抑制劑Fer-1 處理后，細胞中GSH 水平有所升高，MDA 水平得到恢復， 進一步證實鐵死亡與精母細胞損傷有密切關(guān)聯(lián)。因此， 鐵死亡誘導劑RSL3 作用的GC-2 細胞可作為細胞模型進一步探討防治精母細胞鐵死亡的藥物。

鐵死亡過程中，GPX4 能有效清除脂質(zhì)過氧化物，保護精子免受氧化損傷［22-23］。GPX4 是一種硒蛋白，可作為GSH 依賴的過氧化物酶清除脂質(zhì)過氧化物而保護細胞免受脂質(zhì)過氧化，當GSH 合成受阻或者GSH 依賴性的GPX4 在體內(nèi)被抑制時，便會觸發(fā)鐵死亡。在生殖系統(tǒng)中，GPX4 在生殖器官和精子中大量表達，30% 不育男性精子中GPX4表達水平降低［24］。GPX4 活性喪失或低表達已被證實與精子畸形率增高和生育能力下降有關(guān)［25-26］。ACSL4 是一種將CoA 酯化為特定多不飽和脂肪酸（花生四烯酸和腎上腺酸） 的酶［27］。ACSL4 和GPX4 分別正向和負向調(diào)節(jié)鐵死亡［28］。HO-1 可以通過釋放血紅素中的鐵來升高細胞中鐵離子濃度，鐵離子過量可能會促進泛素化脂質(zhì)過氧化物酶的形成，破壞細胞膜完整性，最終引發(fā)鐵死亡。在雄性生殖系統(tǒng)，HO-1 有助于抑制精子和睪丸組織中活性氧的過量積累， 從而保護精子的功能和完整性［26， 29-31］。上述研究提示： 鐵死亡標志分子GPX4、ACSL4 和HO-1 與雄性生殖損有傷密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示： 10 nmol·L-1 鐵死亡誘導劑RSL3 處理的GC-2 細胞中GPX-4 表達水平降低，HO-1 和ACSL4 表達水平升高， 而10 nmol·L-1RSL3 并未對細胞活性產(chǎn)生明顯影響，提示鐵死亡標志分子GPX4、ACSL4 和HO-1 表達水平的變化較細胞活性變化更為敏感，可作為精母細胞損傷敏感標志分子。

AZA 作用機制包括其在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)閹€嘌呤，從而抑制細胞增殖，主要用于治療各種炎癥性和自身免疫性疾?。?2-33］。此外，AZA 也展現(xiàn)了抗氧化應激的潛力，可能通過影響抗氧化酶的表達和調(diào)節(jié)細胞中GSH 水平來保護細胞免受自由基的傷害［34-35］。鐵死亡發(fā)生時，細胞中鐵離子釋放到細胞外，與細胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生反應，導致細胞膜的通透性和完整性受損［36］。因此， 鐵死亡與氧化應激有密切關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示： AZA 能降低RSL3 誘導的精母細胞氧化相關(guān)分子MDA 水平，提升抗氧化分子GSH 水平，證實AZA 抗氧化應激的能力；同時AZA 還可以升高鐵死亡標志分子GPX4 表達水平且降低ACSL4 和HO-1 表達水平， 提示AZA 可作為鐵死亡相關(guān)的潛在治療劑，在防治精母細胞鐵死亡方面發(fā)揮作用，該結(jié)果為研究和治療男性不育提供了新的思路。

綜上所述， AZA 通過對鐵死亡標志分子和MDA 及GSH 等氧化抗氧化相關(guān)分子的調(diào)節(jié)，能夠有效減緩精母細胞鐵死亡進程，從而發(fā)揮對雄性不育的防治作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：葉嚴玨參與選題、實驗操作過程、數(shù)據(jù)收集整理和論文撰寫，湯子怡、陽詩盈和譚鈺培參與論文中數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，劉永和尹俐參與指導論文撰寫。

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