甘草對(duì)小鼠體外精原細(xì)胞分化的影響

金玉姬，潘曉燕，王肖娜，黃茜茜，吳湘軍，李青原，劉洋(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013)

甘草對(duì)小鼠體外精原細(xì)胞分化的影響

金玉姬，潘曉燕，王肖娜，黃茜茜，吳湘軍，李青原，劉洋
(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013)

摘要:目的觀察甘草對(duì)小鼠體外精原細(xì)胞分化的影響。方法取3只小鼠的新鮮睪丸切成組織塊后隨機(jī)分為5組，對(duì)照組不予處理，低濃度組、中濃度組、高濃度組分別加入終濃度為0.2、2.0、20.0 μmol/mL的甘草溶液，卵泡刺激素組加入等量卵泡刺激素培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d。采用免疫組化法觀察并計(jì)數(shù)精母細(xì)胞，計(jì)算精原細(xì)胞分化率。結(jié)果對(duì)照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組和卵泡刺激素組精母細(xì)胞數(shù)分別為( 1.98±0.51)、( 67.23± 8.73)、( 82.57±9.27)、( 117.42±10.93)、( 109.93±11.13)個(gè)，精原細(xì)胞分化率分別為0.38%±0.06%、12.93% ±1.67%、15.87%±2.53%、22.37%±4.37%、20.97%±5.13%;與對(duì)照組比較，其他各組精母細(xì)胞數(shù)及精原細(xì)胞分化率均升高，P均＜0.01;低濃度組、中濃度組和高濃度組兩兩比較，P均＜0.01;高濃度組與卵泡刺激素組比較，P均＞0.05。結(jié)論甘草能促進(jìn)小鼠體外精原細(xì)胞分化為精母細(xì)胞，并呈一定濃度依賴性。

關(guān)鍵詞:甘草;精母細(xì)胞;細(xì)胞分化;小鼠

甘草作為廣泛應(yīng)用的中藥材，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、解毒等作用［1～9］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，甘草能促進(jìn)在小鼠精子發(fā)生過程中精原細(xì)胞的增殖。精子發(fā)生過程很復(fù)雜，歷經(jīng)精原細(xì)胞的增殖和分化、精母細(xì)胞的兩次減數(shù)分裂、精子細(xì)胞的產(chǎn)生等，其中減數(shù)分裂期是關(guān)鍵性的時(shí)間點(diǎn)［10］。聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白( SCP)是初期減數(shù)分裂誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，SCP3是其核心部分，SCP3表達(dá)對(duì)于第一次減數(shù)分裂的完成具有重要作用。2014年6～12月，我們觀察了甘草粗提取物對(duì)SCP3陽性的精母細(xì)胞數(shù)及精原細(xì)胞分化率的影響。

1　材料與方法

1.1材料甘草粗提取物購自瑞芬生物科技有限公司，甘草酸純度為20%;根據(jù)甘草酸的分子量配制成4 mmol/mL的甘草溶液，添加到2 mL的DMEM培養(yǎng)液中，配制成終濃度為0.2、2.0、20.0 μmol/mL的甘草溶液。健康6日齡SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠3只，體質(zhì)量( 3.85±0.36) g，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物資源開發(fā)中心提供;飼養(yǎng)室溫設(shè)定在21～23℃，相對(duì)濕度為55%±5%。所用器具全部經(jīng)蒸壓( 121℃、30 min)及干燥處理( 100℃、4 h)。

1.2小鼠睪丸組織培養(yǎng)及分組處理于無菌操作臺(tái)上摘取小鼠睪丸;去除脂肪和附睪后，將睪丸切成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm的組織塊。將組織塊隨機(jī)分為5組，對(duì)照組不予處理，低濃度組、中濃度組高濃度組分別加入終濃度為0.2、2.0、20.0 μmol/mL的甘草溶液，卵泡刺激素組加入等量卵泡刺激素培養(yǎng)液，于32℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)結(jié)束后，用Bouin氏固定液固定。

1.3小鼠精原細(xì)胞分化情況觀察采用免疫組化法。將培養(yǎng)好的睪丸組織制作成石蠟切片，5 μm厚連續(xù)切片，取4個(gè)不同部位進(jìn)行免疫組化染色。加入一抗抗SCP3抗體(美國(guó)Abcam Biotechnology公司) 4℃下孵育至少6 h，加入二抗(美國(guó)Amersham Biotechnology公司)于常溫下孵育1 h。用DAB和稀釋的蘇木精染色，細(xì)胞核呈茶色為SCP3陽性，即可判斷為精母細(xì)胞。隨機(jī)選取3張切片，計(jì)數(shù)100 000 μm2面積中的精母細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算精原細(xì)胞分化率;實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析( One Way ANOVA) ;兩組間比較，方差齊時(shí)用SNK檢驗(yàn)( Student-Newman-Keuls法)，方差不齊時(shí)用Games-Howell檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

各組精原細(xì)胞分化情況比較，見表1。對(duì)照組幾乎無精母細(xì)胞分化，低濃度組、中濃度組、高濃度組、卵泡刺激素組均有分化的精母細(xì)胞。見插頁Ⅰ

圖5。

表1　各組精原細(xì)胞分化情況比較(珔x±s)

3　討論

研究證實(shí)，甘草具有很強(qiáng)的抗氧化活性。Li等［11］研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素( ISL)能抑制白血病細(xì)胞增殖，可濃度依賴性地降低細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平，但不增加細(xì)胞凋亡率。在一定濃度和時(shí)間條件下，ISL可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，體現(xiàn)出典型的分化細(xì)胞特征，包括質(zhì)核比的減少和腎型核細(xì)胞的增加。ISL能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞中的單核細(xì)胞分化，有潛力成為白血病的治療藥物。

研究發(fā)現(xiàn)，用甘草提取物培養(yǎng)人類脫落乳牙干細(xì)胞( SHEDs)，可通過改變細(xì)胞形態(tài)、增加SHEDs分化成肝細(xì)胞的潛力，提示甘草提取物可作為肝損傷修復(fù)的治療藥物［12］。Fan等［13］研究發(fā)現(xiàn)，甘草總黃酮對(duì)慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激引起的大鼠抑郁行為具有明顯的抑制作用，并且在較大劑量下能對(duì)應(yīng)激引起的海馬神經(jīng)再生損害起到保護(hù)作用。甘草甜素( GL)可通過樹突狀細(xì)胞( DC)干擾免疫反應(yīng)，參與多種免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)［14］。Bordbar等［15］研究表明，GL能上調(diào)小鼠脾臟DC的CD40、CD86和MHC-Ⅱ等成熟標(biāo)志物的表達(dá)，使DC產(chǎn)生更多的IL-12。在混合淋巴球的反應(yīng)中，被處理的DC刺激同種T細(xì)胞，并分泌細(xì)胞因子。DC經(jīng)GL處理后可增加同種間T細(xì)胞的增殖，并產(chǎn)生IFN-γ、IL-10細(xì)胞因子、降低IL-4水平。這表明GL可影響T細(xì)胞的成熟和分化，并提高DC的活性。以上研究說明，ISL具有一定的促細(xì)胞分化作用，提示其在睪丸中也可能有這種作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，其他各組精母細(xì)胞數(shù)及精原細(xì)胞分化率明顯升高，且低濃度組～高濃度組呈一定濃度依賴性。說明甘草在精子發(fā)生過程中對(duì)精原細(xì)胞分化成精母細(xì)胞有明顯的促進(jìn)作用，也可能起到減數(shù)分裂啟動(dòng)的靶點(diǎn)作用。關(guān)于甘草提取物在精原細(xì)胞分化中的具體作用途徑及在睪丸中的作用位點(diǎn)仍有待于進(jìn)一步研究。

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收稿日期:( 2015-01-09)

基金項(xiàng)目:吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目( 20130101147JC) ;吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目( 2013-846)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015) 32-0030-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R 321.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.011