蔡媛媛，徐 霞

（廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗系，廣東 廣州 510182）

Ⅱ型高爾基體膜蛋白GP73的研究進展

蔡媛媛，徐 霞

（廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗系，廣東 廣州 510182）

高爾基體在真核細胞中發(fā)揮著重要作用，在既往的研究中，發(fā)現(xiàn)了很多高爾基體相關(guān)蛋白以及高爾基體膜蛋白，其中有許多都參與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成或運輸過程，但具體的功能尚不明確。在探究高爾基體相關(guān)蛋白功能的時候，一種Ⅱ型高爾基體膜蛋白（TypeⅡGolgi membrane protein，Golph2）引起了研究者的高度關(guān)注。因Golph2多克隆抗血清能夠特異性識別人類上皮細胞裂解物中大小為7.3×104的蛋白分子，故又將這種蛋白稱為GP73（Golgi protein-73）。GP73最初在成人巨細胞肝炎（giant-cell hepatitis，GCH）的病原學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，GCH是肝炎中一種罕見的形式，可能與病毒性致病原感染有關(guān)。在近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)此GP73不僅與病毒感染、肝臟疾病相關(guān)，和其它疾病，尤其是腫瘤疾病都有一定的關(guān)聯(lián)，但該蛋白的研究目前仍處于初步階段，它是否能夠代替甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein AFP）作為肝癌診斷的新標記物，或是成為其它腫瘤診斷或治療的輔助指標，都有待更深層次的研究。本文查閱了近幾年GP73現(xiàn)有的研究狀況，綜述如下，以期為廣大的科研工作者提供參考。

1 GP73的結(jié)構(gòu)和相關(guān)特性

編碼GP73的基因定位于人類染色體9q21.23，cDNA全長為3 042bp，基因序列中包括一個長為1200bp的開放閱讀框（如圖1），框內(nèi)起始部位有兩個編碼甲硫氨酸的密碼子（ATG），這兩個密碼子之間又間隔八個密碼子，為十四（烷）?；蛄校ㄈ鐖D1、2斜體），此序列在一些細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和蛋白的磷酸化、去磷酸化過程中起著重要的作用。從圖1可看出，框內(nèi)3＇端最后有一個終止密碼子，共產(chǎn)生400個氨基酸，計算得到的分子量為45KDa。由于含有大量的酸性氨基酸（Asp5.5%，Glue12.2%），其等電點PI＝4.72，正因為GP73有這樣的性質(zhì)，所以體外重組表達的GP73在變性膠SDS-PAGE中的遷移速度被阻滯［1］，使得所見到的分子量比實際的45KDa稍大，同樣的電泳現(xiàn)象也見于含酸性氨基酸較高的早衰蛋白中。需要注意的是原核重組蛋白的表達是沒有任何修飾的，但在人體血清中GP73經(jīng)過大量糖基化，其分子量在血清檢測中顯示約為73KDa，這比理論的45KDa要大的多。

GP73有很強的親水性，但是卻有著疏水的氨基端，在氨基端編碼的跨膜區(qū)中，第28與29個氨基酸之間有一潛在的信號肽裂解位點。GP73的羧基端位于細胞外，有五個糖基化位點（圖1、2邊框標記），其功能尚不清楚。緊鄰跨膜區(qū)發(fā)現(xiàn)了一些卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)參與蛋白之間的相互作用。GP73可能代表著另一種高爾基Ⅱ型膜蛋白，如高爾基磷酸蛋白GPP130，這種蛋白與GP73結(jié)構(gòu)相似，都含有大量的酸性氨基酸，都有卷曲結(jié)構(gòu)。

圖1 開放閱讀框堿基序列

圖2 編碼的氨基酸序列

Kladney等人利用高pH值處理微粒體的方法證明了GP73為具有Ⅱ型拓撲結(jié)構(gòu)的完整膜蛋白，且不在細胞表面表達，是一種定居于高爾基體的蛋白；研究者也證明了GP73沒有任何低聚糖修飾和特異性酶的性質(zhì)。

GP73自身的性質(zhì)很復(fù)雜，作用可能體現(xiàn)在細胞內(nèi)運輸、細胞信號傳導(dǎo)以及蛋白組裝和修飾中。Wright等采用基因捕獲法建立了羧基端截短型的GP73小鼠模型［2］，這種小鼠具有2個特點：（1）出生率高，繁殖速度快，但是積累生存率低（尤其是雌鼠）；（2）常伴有不同程度的肝、腎形態(tài)學(xué)改變［3］。這個實驗部分證明了GP73功能的重要性。

2 GP73在正常人體組織中的分布情況

正常人體中的大部分組織都能表達GP73，提示GP73可能發(fā)揮著類似管家基因的作用。免疫組化結(jié)果顯示，GP73主要在上皮細胞系中表達，如腸道中，GP73僅局限于腸腺柱狀上皮細胞，尤其是在腺體表面的上皮細胞中含量最多；在肺的細支氣管柱狀纖毛上皮細胞中也發(fā)現(xiàn)了GP73的痕跡；腎臟遠曲小管和集合管中，GP73顯示出很強的表達信號，但在腎小球中，GP73的表達很少，甚至沒有表達；在前列腺，GP73的表達也僅限于該腺體的上皮細胞；在正常的肝組織中，GP73在膽管上皮細胞中持續(xù)表達，而在肝細胞中，GP73不表達，即使表達，量也很少，并且僅在門靜脈周圍分散的細胞中表達。

3 GP73與病毒感染

GP73為高爾基蛋白，而這類蛋白的功能研究尚不完善，早期的研究集中于病毒感染對高爾基體的干擾，從而間接研究此類蛋白的功能，文獻報道了很多病毒對高爾基體功能的影響，如皰疹病毒，巨細胞病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒。GP73最初是在一例成年GCH患者的肝細胞中發(fā)現(xiàn)的，GCH是肝炎的一種罕見形式，推測是由病毒感染引起，由此，研究人員設(shè)想用病毒感染肝細胞系，看是否能誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生GP73［4］。在體外實驗中，已經(jīng)建立了腺病毒感染HepG2細胞的模型，而且已證明了GP73是在腺病毒感染早期表達的，提示GP73可能是一種新型的病毒反應(yīng)性蛋白。需要注意的是，在體外新城疫病毒（Newcastle virus infection）感染模型中也首次分離出了部分GP73cDNA，所以GP73的反應(yīng)性并不單局限于一種或是一類病毒，但單就腺病毒來說，腺病毒的某些基因?qū)P73的表達是必須的，因為在腺病毒5（Ad5）和腺病毒2（Ad2）感染肝癌Hep3B細胞的實驗中發(fā)現(xiàn)，敲除腺病毒基因E1A羧基端上的CID（CtBP interaction domain，CID），GP73不表達，而未敲除該基因的腺病毒則可以誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生GP73?？偟膩碚f，一方面GP73的表達也許影響病毒的復(fù)制、病毒蛋白的轉(zhuǎn)運、以及病毒微粒體的成熟，另一方面，它也可能導(dǎo)致正常細胞功能的失調(diào)，如影響細胞的分化及壽命。

4 GP73與肝臟疾病的關(guān)系

4.1 GP73與肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）之間的關(guān)系

HCC是世界五大常見癌癥之一，其增長速度非常之快。肝硬化是HCC發(fā)病過程中的一個重要發(fā)展過程［5］，因此，肝硬化患者組成了HCC的高危人群，目前，在肝硬化患者中，AFP是唯一推薦檢測HCC的血清標志物［6］，另外還有影像學(xué)檢查，但是同樣存在著局限性，如果腫瘤體積較小，影像方法也很難檢出。為了提高患者的生存率，就非常需要一種能夠檢測出早期HCC的方法。研究者也提出了多種 腫 瘤 標 記 物，如 AFP-L3［7］，腫 瘤 生 長 因 子TGF-β，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）等［8］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GP73以良好的敏感性被視為最有潛力的HCC標記物［9］。GP73在正常肝細胞中少量表達甚至不表達，而在HCC中，GP73的血清水平顯著增高［10］，國外研究者發(fā)現(xiàn)在早期HCC的診斷中，GP73敏感性為62%，而AFP的敏感性僅為25%，即GP73是較AFP更有優(yōu)勢的一種早期檢測HCC的血清標志物［11］。在國內(nèi)，研究人員用western blot方法比較了HBV患者、HCC患者和健康人中GP73與AFP的血清水平，發(fā)現(xiàn)GP73診斷HCC的敏感性為73%，而AFP僅為48.6%［12］。與此同時，研究通過肝癌組與健康組的對照，國際上首先確立了GP73的正常值為1.2（0.9－1.7）相對單位，肝癌組血清GP73平均值為14.7（8.9－29.4）相對單位，遠高于健康對照組，且與腫瘤個體的大小無關(guān)，與是否攜帶乙肝病毒也沒有顯著差異［13］。

4.2 GP73與肝臟良性疾病之間的關(guān)系

GP73的異常表達同肝臟多種疾病相關(guān)，研究人員發(fā)現(xiàn)，急慢性肝炎、酒精肝、自身免疫性肝炎以及Wilson疾病中，肝細胞中GP73的表達都有一定程度的增高。其中，自身免疫性肝炎經(jīng)免疫抑制劑治療后，GP73表達明顯降低，這表明在自身免疫性肝炎中GP73表達上調(diào)是可逆的。而慢性丙肝和酒精肝病人的疾病分級同GP73水平的相關(guān)性不明顯，由此可見，GP73在急慢性肝臟疾病中都可以出現(xiàn)一定程度的表達，這種蛋白對肝臟疾病的病因診斷可能沒有幫助，但可以作為肝臟疾病的血清標志物。另外Wilson病肝細胞中GP73含量增高與銅超載無關(guān)［14］，主要是由肝臟的炎癥、纖維化及發(fā)育不良所致。

5 GP73與睪丸腫瘤之間的關(guān)系

睪丸腫瘤在年輕人中已經(jīng)成為一種較常見的腫瘤疾病，且發(fā)病率逐年上升，其可分為兩大類：生殖細胞瘤（testicular germ cell tumours GCT）和性腺基質(zhì)細胞瘤（sex cord-stromal tumours）。GCT 是一種高異質(zhì)性腫瘤，又可以分為精原細胞瘤和非精原細胞瘤。在非精原細胞瘤中，間質(zhì)細胞瘤（leydig cell tumours，LCT）是最常見的，雖然LCT通常是良性腫瘤，但有10%的惡變可能，并且對放化療治療不敏感，同其他GTC相比，預(yù)后非常差，唯有進行早期診斷，爭取治療時間才有可能挽救病人的生命［15］。但是LCT沒有合適的標記物，目前對LCT隱匿轉(zhuǎn)移可能性的估計是以腫瘤細胞形態(tài)學(xué)的變化來判斷的，也有如鈣網(wǎng)膜蛋白、α－抑制素、黑色素A等免疫組化標記物，但是它們的特異性不高，尤其是不能區(qū)分腎上腺皮質(zhì)細胞瘤和黑素瘤細胞的睪丸轉(zhuǎn)移癌，所以為了更進一步了解睪丸腫瘤的生物行為，建立合適的治療方法，研究者對該腫瘤中GP73的分布進行了深入研究。

研究發(fā)現(xiàn)，與睪丸腫瘤組織相比，正常組織中GP73的含量極低甚至是沒有，但在睪丸精原細胞瘤的患者中，GP73的表達水平大幅提高。在精原細胞瘤中，GP73呈顆粒狀，偶爾簇裝聚集，非常容易辨別，并且GP73的形態(tài)不會隨著腫瘤的發(fā)展和年齡的差異而發(fā)生變化，因而非常有利于臨床檢查［16］。同樣，在LCT中，GP73也呈高表達，但是在正常睪丸間質(zhì)細胞（leydig cell）中，GP73的表達量也非常之高，這種現(xiàn)象需要我們更進一步的研究GP73在生理學(xué)和病理學(xué)上功能的區(qū)別。睪丸間質(zhì)細胞是內(nèi)分泌型細胞，分泌各種激素，包括雄激素、雌激素，GP73在該細胞中的高表達，為進一步研究GP73在內(nèi)分泌腺中的功能做了鋪墊。

6 GP73與前列腺癌的關(guān)系

前列腺癌的診斷往往依賴于前列腺穿刺標本的病理檢查，但活檢標本取材有限，僅僅靠光鏡下的組織學(xué)形態(tài)有時很難鑒別，這給診斷條件增加了難度，甚至造成誤診。目前分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)證明，前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是多種癌基因和抑癌基因共同作用的結(jié)果，可以從蛋白水平和基因水平檢測前列腺癌。近年研究發(fā)現(xiàn)α－甲基?；o酶A消旋酶（α-methylacyl-CoA recemase AMACR）在前列腺癌中具有高度特異性和敏感性，P63也是目前基底細胞的可靠標記物，但在一些病例中，此疾病的診斷仍然存在著很多困難，雖然AMACR被廣泛作為前列腺癌的陽性標記物使用，但卻有顯著的兩個局限性：內(nèi)部腫瘤異質(zhì)性的分辨率不高；存在著AMACR陰性腫瘤。同時P63在多數(shù)前列腺腫瘤中是不表達的，這使得研究者不得不尋找其他的標記物，有報道指出，在大量臨床前列腺癌切除的組織中發(fā)現(xiàn)了GP73［17］。研究表明，如將GP73作為輔助標記物，AMACR陰性腫瘤的檢出率可大幅度提高［18］。但是GP73不推薦作為主要的標記物，因為它的敏感性不如AMACR，并且，在高度可塑性的良性腫瘤中，GP73的表達量同樣上升，所以研究者僅建議，將GP73作為輔助標記物，來檢測AMACR陰性的前列腺癌。

7 GP73與食管癌的關(guān)系

食管癌的五年存活率小于15%，其治療方法主要包括手術(shù)切除，化療和放療。在化療中會出現(xiàn)耐藥性，這使得化療效果大打折扣。如順氯胺鉑（cisdiamminedichloroplatinum II CDDP）是使用最廣泛的抗癌藥，但是CDDP很容易導(dǎo)致獲得性耐藥，從而影響了CDDP治療食管癌的效果。為了研究CDDP產(chǎn)生耐藥性的原因，實驗者分析了一系列食管癌基因，探究哪些基因可以影響對CDDP的敏感性。研究表明食管癌的TE4細胞系中的GP73的表達可以使細胞產(chǎn)生對CDDP的耐藥性，抑制TE4細胞中GP73的表達，可以重新讓細胞恢復(fù)對CDDP的敏感［19］，從而更好的治療食管癌，這為避免食管癌耐藥性的出現(xiàn)開辟了新的治療途徑。

另外，GP73與肺癌也有一定的關(guān)聯(lián)，肺癌可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（nonosmall cell lung cancer，NSCLC），NSCLC又可分為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞肺癌，其中以腺癌占多數(shù)，GP73在腺癌中的表達量較其它類型的肺癌要明顯的多，但由于肺腺癌細胞來源于顆粒上皮細胞，屬于外分泌腺體，只能將GP73快速分泌到肺泡里去，所以GP73不太可能作為肺腺癌的血清標記物，只有采取新的檢測方法，才能更好的在臨床區(qū)分肺癌分類中發(fā)揮作用，在該研究過程中，再次證明了GP73與性別相關(guān)，相同的肺腺癌中，女性的GP73的表達強度明顯高于男性［20］。

綜上所述，早期研究者認為GP73可以作為HCC的血清標記物，到目前為止，GP73在許多腫瘤中都出現(xiàn)了不同程度的增多表達［21］，如前所述的前列腺癌，食管癌，精原細胞瘤，還有沒有提及的尿道細胞癌，腸道癌，乳腺癌等，那么GP73是否在上述之外的其它腫瘤中也有表達？這需要我們更深入的研究，但不管怎樣，GP73作為一個新的高爾基蛋白，在諸多腫瘤中都有增多表達，必定有它自身存在的意義。另外，GP73作為潛在的腫瘤標記物，不管它將來對哪種腫瘤最具有特異性，首先要建立一種經(jīng)濟、簡便的抗干擾能力強的方法來檢測GP73，這樣才能真正將GP73的價值推廣運用于臨床。

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