高效液相色譜法檢測(cè)化妝品中著色劑羅丹明B、金光紅C和顏料紅57

田富饒，楊委，楊蘭花，孫文閃

(義烏出入境檢驗(yàn)檢驗(yàn)局，浙江義烏 322000)

隨著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的蓬勃發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，化妝品逐步從奢侈品轉(zhuǎn)變?yōu)槿粘Ｉ畹谋匦杵?。但是化妝品中的一些物質(zhì)常常會(huì)給消費(fèi)者的健康帶來(lái)一定的損害，這其中就包括色素。特別是對(duì)于修飾類化妝品，由于在此類化妝品中大量使用了色素，且使用的色素多數(shù)是合成染料[1]，長(zhǎng)期或過(guò)量使用會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在的危害，如有的著色劑會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，還有的著色劑能透過(guò)皮膚被人體吸收，長(zhǎng)期使用此類產(chǎn)品甚至可以誘發(fā)癌癥。

為保護(hù)消費(fèi)者健康安全，美國(guó)的食品和藥物管理局(FDA)、歐盟的歐洲委員、日本的厚生勞動(dòng)省等3個(gè)主要的監(jiān)管當(dāng)局和中國(guó)的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007)以及GB7916-1987《化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)化妝品中可以使用的色素都有明確規(guī)定。美國(guó)規(guī)定，顏料紅57(CI 15850)在眼部化妝品中禁用，羅丹明B(CI 45170)和金光紅C(CI 15585)在所有化妝品中禁用；歐盟規(guī)定，顏料紅57(CI 15850)和羅丹明B(CI 45170)禁用，金光紅C(CI 15585)暫時(shí)可以用于化妝品中；日本規(guī)定，這3種色素不能用于粘膜的化妝品中，其它的化妝品中可以使用；中國(guó)規(guī)定，顏料紅57(CI 15850)在所有化妝品中可以用，羅丹明B(CI 45170)和金光紅C(CI 15585)在所有化妝品中禁用。

對(duì)于著色劑的檢測(cè)方法，目前國(guó)內(nèi)外有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS／MS)、高效液相色譜-紫外可見(jiàn)檢測(cè)法(HPLC-UV)及高效液相色譜 - 二極管陣列檢測(cè)法 (HPLC-DAD)[2-9]，特別是對(duì)水溶性著色劑[6，8-9]的研究較為普遍，但是對(duì)于化妝品中顏料紅57、金光紅C、羅丹明B的檢測(cè)目前尚未形成完整和成熟的方法，非常不利于對(duì)化妝品市場(chǎng)的監(jiān)督和管理。因此，筆者研究的高效液相色譜法檢測(cè)化妝品中著色劑羅丹明B、金光紅C和顏料紅57，對(duì)于提高我國(guó)化妝品質(zhì)量安全管理水平、有效應(yīng)對(duì)國(guó)外技術(shù)性貿(mào)易壁壘、促進(jìn)經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易發(fā)展具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，帶二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；

超聲波清洗器：D-78224型，德國(guó)Elma公司；

高速離心機(jī)：3-30K型，德國(guó)Sigma公司；

紫外分光光度計(jì)：Carry100型，美國(guó)安捷倫公司；

分析天平：AL204型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

超純水儀：Milli-Q型,美國(guó)密理博公司；

旋渦混勻器；

四丁基氫氧化銨(TBA)：10%水溶液，上海滬南化工有限公司；

有機(jī)性樣品濾膜：0.45 μm；

一次性注射器：2.5 mL；

甲醇：色譜純；

N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、氫氧化鉀、磷酸：均為分析純；

羅丹明B(CI 45170 )標(biāo)準(zhǔn)品：CAS編號(hào)81-88-9，純度96.7%，上海安普科學(xué)儀器有限公司；

金光紅C (CI 15585)標(biāo)準(zhǔn)品：CAS編號(hào)5160-02-1，純度90%，上海安普科學(xué)儀器有限公司；

顏料紅57(CI 850)標(biāo)準(zhǔn)品：CAS編號(hào)5281-04-9，純度87.2%，上海安普科學(xué)儀器有限公司；

TBA-KOH溶液：稱取0.280 g氫氧化鉀和1.297 g 10% TBA水溶液，溶解至水中，定容至1 L，用磷酸調(diào)至pH 7.00；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇 -TBA-KOH 溶液，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；柱溫：30℃；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：羅丹明B為550 nm，顏料紅57和金光紅C為480 nm。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，先用DMF配成單標(biāo)貯備液，再配成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度分別為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 mg／L(顏 料 紅 57)；0.25，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg／L(金光紅 C)；0.25，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg／L(羅丹明 B)。

1.4 樣品前處理

稱取化妝品試樣約0.2 g(精確至0.001 g)于50 mL具塞比色管中，加入20 mL DMF，渦旋振蕩使試樣與提取溶劑充分混勻后，在超聲波清洗器中超聲提取40 min，自然冷卻至室溫，將提取液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用DMF定容至刻度，必要時(shí)，轉(zhuǎn)移至50 mL具塞塑料離心管中，以5000 r／min離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，所得濾液供液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑

先后用甲醇、無(wú)水乙醇、乙醇-水、乙腈、四氫呋喃、氯仿等試劑來(lái)溶解標(biāo)準(zhǔn)品。試驗(yàn)結(jié)果表明，顏料紅57和金光紅C在這些溶劑中的溶解性很差，而這3種著色劑在DMF溶劑中均有很好的溶解性，最終選用DMF作為提取溶劑。

2.2 提取時(shí)間

在其它條件一致的情況下，分別將樣品超聲提取 20，30，40，50，60，70 min，測(cè)定待測(cè)物的含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，待測(cè)物的含量在不斷增加，但是在40 min以后增加不明顯，最終選擇最佳提取時(shí)間為40 min。

2.3 流動(dòng)相

本試驗(yàn)先后嘗試了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸銨、甲醇-磷酸二氫銨作為流動(dòng)相，在以上流動(dòng)相條件下峰型很差，均不能達(dá)到分離的目的。然后考慮在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，先后分別加入TBA、TBA-KOH來(lái)改善峰形和分離效果，在只加入TBA的情況下仍然達(dá)不到分離的目的，將TBA-KOH一起使用時(shí)分離效果較好。對(duì)于使用濃度，根據(jù)文獻(xiàn)[4]并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的實(shí)際條件，使用5 mmol／L的TBA-KOH水溶液就能使3種著色劑達(dá)到良好的分離，因此最終選用甲醇和5 mmol／L的TBA-KOH水溶液作為流動(dòng)相。在1.2所述的最佳色譜分析條件下，3種著色劑分離效果良好，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖2。

2.4 流動(dòng)相的pH值

在離子對(duì)試劑種類和濃度一定的情況下，考察pH值對(duì)保留時(shí)間的影響，根據(jù)文獻(xiàn)[4]并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的實(shí)際條件，調(diào)節(jié)pH值至7.00。結(jié)果表明，在此pH值條件下，分離效果良好(分離度、拖尾因子、對(duì)稱因子、塔板數(shù)等都能達(dá)到要求)，因此確定流動(dòng)相的pH值為7.00。

2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)

首先，以DMF為溶劑，用紫外-可見(jiàn)分光光度儀對(duì)羅丹明B、顏料紅57和金光紅C在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描，由掃描結(jié)果可知，羅丹明 Bλmax=560 nm、顏料紅 57λmax=474 nm、金光紅Cλmax=481 nm。

其次，根據(jù)HPLC-DAD的光譜信號(hào)，由光譜圖可知，3種著色劑的最大吸收波長(zhǎng)分別是羅丹明Bλmax=550 nm、顏料紅 57λmax=480 nm、金光紅 Cλmax=480 nm。

結(jié)合光譜圖和紫外掃描圖譜，確定3種著色劑的檢測(cè)波長(zhǎng)為羅丹明B：550 nm，顏料紅57和金光紅C：480 nm。

2.6 方法的線性范圍和檢出限

對(duì)3種目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度(見(jiàn)表2)范圍內(nèi)的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)組分的峰面積y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x(mg／L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.9999。以信噪比(S／N)為10計(jì)算檢出限，其線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見(jiàn)表2。

表2 3種著色劑的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限

2.7 方法的回收率和精密度

采用在空白樣品中加標(biāo)的方法進(jìn)行回收試驗(yàn)。稱取不同類型的化妝品試樣約0.2 g多份，分別加入高、中、低3檔不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5所述方法提取后上機(jī)測(cè)定，進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)取平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同化妝品中3種著色劑的回收率和精密度(n=6)

2.8 實(shí)際樣品分析

選取不同類型的化妝品樣品進(jìn)行測(cè)定，從測(cè)定結(jié)果看，大部分化妝品都添加了1到2種著色劑，添加種類最多的是顏料紅57。

3 結(jié)論

著色劑是化妝品的重要組分成分，本實(shí)驗(yàn)建立了一種高效液相色譜技術(shù)同時(shí)檢測(cè)化妝品中著色劑顏料紅57(以鈣鹽計(jì))、金光紅C和羅丹明B的方法。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，可以為化妝品中著色劑的檢測(cè)提供實(shí)用的技術(shù)手段，對(duì)監(jiān)測(cè)化妝品中著色劑的使用情況具有重要的意義。目前國(guó)家尚未對(duì)化妝品中限量或禁用著色劑有明確的規(guī)定，該方法可以為相關(guān)規(guī)定的制定提供一定的技術(shù)支持。

[1]楊艷偉，朱英，劉思然，等.化妝品中著色劑使用情況的調(diào)查[J].環(huán)境與健康雜志，2012，29(2): 170-172.

[2]Gagliardi L，Orsi D De，Cavazzutti G，et al. HPLC determination of Rhodamine B (CI 45170) in cosmetic products[J].Chromatographia，1996，43: 76-78.

[3]Wegenerl J W，Klamer J C，Govers H，et al. Determination of organic colorants in cosmetic products by high-performance liquid chromatography[J].Chromatographia，1987，24: 866-875.

[4]Rastogi S C，Barwick V J，Carter S V. Identification of organic colourants in cosmetics by HPLC-diode array detection[J].Chromatographia，1997，45: 215-228.

[5]馬艷鳳，李瓊，武曉劍.高效液相色譜法定量檢測(cè)化妝品中著色劑顏料紅49 [J].日用化學(xué)工業(yè)，2011，41(6): 455-458

[6]李瑋，芮昶，屠海云，等.高效液相色譜法測(cè)定化妝品中的7 種色素[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2011，30(12): 85-89.

[7]郭桂媛，林維宣，金紅利，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中的4種禁用著色劑[J].日用化學(xué)工業(yè)，2011，41(3): 229-231.

[8]孫小穎，李英，劉麗，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中的9種水溶性著色劑[J].色譜，2009，27(6): 852-855.

[9]朱杰民，謝劍鋒，杜達(dá)安.高效液相色譜法測(cè)定化妝品中7種水溶性合成著色劑[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2005，11(4): 423-426.