王京京

(北京市昌平區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，北京 102200)

高效液相色譜(HPLC)法是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分析分離技術(shù)，它是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，采用高壓輸送流動相和高靈敏度檢測器，發(fā)展而成的現(xiàn)代液相色譜分析方法，具有分離度高、選擇性好、分析速度快、檢測靈敏度高、操作自動化程度高和應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)[1]。

苯甲酸、山梨酸是食品行業(yè)中常用的食品防腐添加劑，乙?；前彼徕?安賽蜜)、天門冬酰苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜)、糖精鈉則是食品中常用的甜味劑。在目前所使用的添加劑中，絕大多數(shù)為化學(xué)合成添加劑，它們是通過氧化、還原、縮合等一系列化學(xué)合成反應(yīng)所得，有的具有一定的毒性，有的在食品中起變態(tài)反應(yīng)或轉(zhuǎn)化成其它有毒物[2]。我國標(biāo)準(zhǔn)GB 2760–2011中明確規(guī)定了乳酸菌飲料中各種添加劑的使用種類和限量標(biāo)準(zhǔn)[3]。因此建立一種快速、準(zhǔn)確、同時(shí)檢測多種防腐劑和甜味劑的方法對于食品行業(yè)的監(jiān)管意義重大。

高效液相色譜法是目前甜味劑和防腐劑定量分析的首選方法[4–7]，但國家標(biāo)準(zhǔn)方法對3種以上甜味劑與防腐劑同時(shí)檢測的標(biāo)準(zhǔn)較少，且乳飲料一般含鮮乳成分或乳粉和一些增稠劑，給樣品前處理工作帶來了較大的難度。筆者對樣品前處理及上機(jī)測定條件進(jìn)行了深入研究，成功地建立了快速測定乳酸菌飲料中2種防腐劑和3種甜味劑的高效液相色譜法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，配有紫外可見光檢測器和Rev.06色譜工作站，美國安捷倫公司；

超聲振蕩器：KQ2200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

高速離心機(jī)：SIGMA 3K30型，德國Sigma公司；

電子天平：AE系列，梅特勒–托利多儀器(上海)有限公司；

甲醇：色譜純，美國FISHER公司；

乙酸銨、硫酸銨、乙酸鋅、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、無水乙醇：分析純，北京化學(xué)試劑廠；

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：乙酰磺胺酸鉀、苯甲酸、山梨酸濃度均為1.0 mg／mL(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)，糖精鈉濃度為1.0 mg／mL(北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司)；

天門冬酰苯丙氨酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度不小于99%，中國計(jì)量科學(xué)研究院；

實(shí)驗(yàn)用水：電導(dǎo)率為0.0768 μS／cm的去離子水。

1.2 色譜條件

色譜柱：XDB–C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；紫外檢測波長為230 nm，從13 min開始將紫外檢測波長切換至205 nm；柱溫：35℃；流動相為甲醇和0.02 mol／L乙酸銨溶液組成，流速為1.0 mL／min。

梯度洗脫程序：0～14 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為5%；14～18 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)由5%增至39%；18～23 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為39%，流速降為0.8 mL／min；23～26 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)由39%減至 5%，流速恢復(fù)至 1 mL／min；26～30 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為5%。

1.3 樣品前處理

稱取約5 g混合均勻的乳酸菌飲料樣品(精確至0.001 g)于50 mL容量瓶中，加入12%乙酸鋅溶液與12%亞鐵氰化鉀溶液各2 mL沉淀蛋白，加水至標(biāo)線，搖勻，放入超聲波振蕩器中超聲波提取10 min，放入冰箱冷藏沉淀20 min。將樣品轉(zhuǎn)入離心管中以7000 r／min離心5 min，取上清液過0.45 μm尼龍濾膜，供上機(jī)待測。

1.4 測定

(1)標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

乙?；前匪徕?安賽蜜)、苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液可直接配制使用。天門冬酰苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)100℃減壓干燥4 h至恒重，準(zhǔn)確稱取50.0 mg至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，濃度為1.00 mg／mL。

(2)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制

準(zhǔn)確吸取乙?；前匪徕?、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)儲備液各5.00 mL于100 mL容量瓶中，用水定容，得到質(zhì)量濃度均為0.05 mg／mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。分別吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1.00，2.00，4.00，8.00 mL 于 10 mL 容量瓶中，各加水至標(biāo)線得到含乙?；前匪徕?、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)濃度為 5.00，10.00，20.00，40.00 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對乙酰磺胺酸鉀、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)濃度為 5.00，10.00，20.00，40.00 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液以自動進(jìn)樣器各進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行HPLC分析，然后以峰面積為縱坐標(biāo)，以乙?；前匪徕?、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、阿斯巴甜的濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4)樣品測定

以自動進(jìn)樣器取樣品處理液20 μL進(jìn)樣，以保留時(shí)間定性，根據(jù)外標(biāo)法以峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長選擇

在200～300 nm范圍內(nèi)，用紫外–可見光分光光度計(jì)檢測乙?；前匪徕洝⒈郊姿?、山梨酸、糖精鈉、天門冬先苯丙氨酸甲酯5種物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其敏感波長分別為 226，229，260，202，200 nm。因此選擇 230 nm為起始檢測波長，后期利用可變波長檢測器的波長切換功能將掃描波長變更為205 nm，以達(dá)到不同波長吸收范圍的物質(zhì)都能有較大響應(yīng)值。

2.2 流動相的選擇

5種組分極性的較大差異是它們能徹底分離的先決條件，為了使各組分能夠很好的分離，分別對流動相的pH值以及洗脫梯度等條件進(jìn)行了優(yōu)化[8]。實(shí)驗(yàn)對比了乙酸銨–甲醇與硫酸銨–甲醇流動相體系。結(jié)果表明，0.02 mol／L乙酸銨與甲醇體系的分離洗脫效果最佳，而以硫酸銨(0.02 mol／L)–甲醇為流動相體系時(shí)，乙?；前匪徕?安賽蜜)和天門冬酰苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜)峰形有一定程度的拖尾現(xiàn)象；當(dāng)乙酸銨緩沖液的pH值分別為4.0，5.0，6.0時(shí)，pH值的變化對5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間及峰形均產(chǎn)生不同程度的影響。當(dāng)乙酸銨緩沖溶液的pH值為4.0時(shí)，峰形出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，且山梨酸與糖精鈉出峰時(shí)間換位。當(dāng)乙酸銨緩沖溶液pH 5.0時(shí)，峰形得到改善，但對稱性達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求。當(dāng)乙酸銨緩沖液的pH 6.0時(shí)，峰形對稱，拖尾現(xiàn)象有明顯改善。因此確定pH值為6.0的乙酸銨緩沖液為流動相。以乙酸銨(0.02 mol／l)–甲醇體積比為95∶5為流動相對組分進(jìn)行分離時(shí)，阿斯巴甜在30 min內(nèi)無法檢出，因此采用梯度淋洗，14 min后增加甲醇比例，調(diào)整為乙酸銨(0.02 mol／L)–甲醇體積比61∶39，加強(qiáng)了洗脫強(qiáng)度，縮短了分析時(shí)間。

通過對流動相比例調(diào)整、梯度安排、pH值調(diào)節(jié)，并利用可變波長檢測器的特征對檢測過程中不同波長的選擇試驗(yàn)，最終確定了1.2最佳實(shí)驗(yàn)條件。檢測器用變波長掃描：0～13 min內(nèi)，波長為230 nm；13～30 min內(nèi)，波長為205 nm。此條件下，5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能完全分離且峰形對稱，一次進(jìn)樣分析時(shí)間可控制在25 min。圖1、圖2分別為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖和乳酸菌飲料樣品色譜圖。

2.3 樣品前處理沉淀劑的選擇

樣品中的蛋白質(zhì)對色譜系統(tǒng)尤其是液相色譜柱會產(chǎn)生不良影響，應(yīng)在前處理過程中沉淀蛋白，根據(jù)現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T 5009.29–2003，使用5%硫酸銅沉淀蛋白質(zhì)，對于含蛋白較少的食品尚可，但對于乳制品等高蛋白含量的食品則沉淀效果不太理想[9]。實(shí)驗(yàn)選擇下面3組蛋白沉淀劑進(jìn)行比較試驗(yàn)。

(1)12%乙酸鋅溶液2.0 mL 和12%亞鐵氰化鉀溶液2.0 mL；

(2)12%乙酸鋅溶液2.0 mL 和20%氫氧化鈉2.0 mL；

(3)無水乙醇10 mL。

采用方案(1)12%乙酸鋅溶液2.0 mL和12%亞鐵氰化鉀溶液2.0 mL為沉淀劑沉淀蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此兩種沉淀劑不干擾目標(biāo)物的檢測，操作簡單，沉淀快速。5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的加標(biāo)回收率均在80%以上；采用方案(2)12%乙酸鋅溶液2.0 mL和20%氫氧化鈉2.0 mL為沉淀劑，發(fā)現(xiàn)此沉淀?xiàng)l件下苯甲酸和糖精鈉的加標(biāo)回收率均比較理想，但由于使用了氫氧化鈉，待測樣品溶液堿性增強(qiáng)，對C18分析柱的壽命有一定影響；而選擇方案(3)無水乙醇10 mL，須在水浴鍋中對樣品進(jìn)行加熱，使蛋白質(zhì)變性，操作復(fù)雜，且沉淀劑用量較大，引入干擾概率加大，對加標(biāo)回收有一定負(fù)面影響。

綜上所述實(shí)驗(yàn)選用(1)12%乙酸鋅溶液2.0 mL和12%亞鐵氰化鉀溶液2.0 mL作為乳飲料的蛋白沉淀劑。

2.4 線性關(guān)系及檢出限

在實(shí)驗(yàn)條件下，按1.4(3)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，5種目標(biāo)分析物的濃度x(mg／L)與峰面積y之間呈良好的一次線性關(guān)系，線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表1。由表1可知，相關(guān)系數(shù)大于0.9996，檢出限為0.01～0.05 mg／L。檢出限計(jì)算方法為：配制1個(gè)低濃度樣品進(jìn)行測定，計(jì)算其信噪比，然后以該濃度除以信噪比再乘以3倍，即該方法對該物質(zhì)的檢出限。

表1 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)

2.5 樣品加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)

對乳酸菌飲料樣品進(jìn)行3水平添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平取5個(gè)平行樣，加標(biāo)回收試驗(yàn)色譜圖見圖3，回收試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，加標(biāo)回收率為90%～102%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%～4.3%，各組分檢出限均為0.5 mg／kg，說明本實(shí)驗(yàn)的回收率與精密度較高，準(zhǔn)確度和精密度符合實(shí)際樣品的檢測要求。

表2 回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)

3 結(jié)語

研究了高效液相色譜同時(shí)測定乳酸菌飲料中乙酰磺胺酸鉀、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、天門冬先苯丙氨酸甲酯5種食品添加劑的提取和分析條件，建立了合適的樣品提取的前處理方法，并對高效液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了最佳色譜條件。方法靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度均較高，符合檢測要求。同時(shí)操作簡便、快捷，能在30 min 內(nèi)將5種添加劑基本分離，達(dá)到日常測定樣品的要求。

[1]張曉彤.液相色譜檢測方法[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000:6–44.

[2]黃海龍，莊莉，崔群，等.高效液相相色譜法同時(shí)測定榨菜中的10 種食品添加劑[J].化學(xué)計(jì)量分析，2011，20(5): 20–22.

[3]GB 2760–2011 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[4]GB／T 5009.29–2003 食品中山梨酸、苯甲酸的測定[S].

[5]GB／T 5009.28–2003 食品中糖精鈉的測定[S].

[6]GB／T 5009.140–2003 食品中乙?；前匪徕浀臏y定[S].

[7]GB／T 22254–2008 食品中阿斯巴甜的測定[S].

[8]張秀堯.反相高效液相色譜法同時(shí)快速測定食品中常見的8種食品添加劑[J].色譜，2000，18(6): 539–542.

[9]魯琳，高燕紅，許秀敏.乳飲料中5種甜味劑和2種防腐劑的高效液相色譜快速測定法[J].環(huán)境與健康雜志，2009，26(8):716–718.