王雪松 李常國

（遼寧省食品藥品檢驗所，沈陽 110023）

馬立克氏病（MD）是最常見的一種雞淋巴組織增生性傳染病。它是由馬立克氏病毒（MDV）引起雞的一種高度接觸性傳染性腫瘤疾病，以淋巴組織的增生和腫瘤形成為特征。馬立克氏病是危害世界養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的病毒性腫瘤性傳染病。MD經(jīng)羽毛囊排毒，空氣傳播，傳染力極強，是雞的3大主要疫病之一。該病于1907年由匈牙利病理學(xué)家Joseph Marek首先報道，1961年在英國科學(xué)家Biggs的倡導(dǎo)下，開始使用馬立克病這一名稱。MD存在于世界所有養(yǎng)禽的國家和地區(qū)，其危害隨著養(yǎng)雞業(yè)的集約化而增大，此病一旦發(fā)生，即可引起雞大批死亡，給養(yǎng)雞業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。MD是一種高度接觸性疾病，通過直接或間接接觸傳播，也可通過空氣傳播。

在實習期間，我們確診4例MD。病雞大多表現(xiàn)為精神不振，食欲減退，羽毛松散，縮頭耷翅，雞冠和肉髯蒼白萎縮，貧血，排水樣稀便及黃白色或黃綠色下痢。病雞消瘦迅速，體重減輕，昏迷，最后衰竭死亡。通過剖檢變化，病理組織學(xué)觀察以及瓊脂擴散試驗，在與其他癥狀相似的疾病相鑒別后，最后確診為雞馬立克氏病。

MD主要侵害外周神經(jīng)系統(tǒng)，以周圍神經(jīng)、性腺、虹膜、內(nèi)臟器官、肌肉和皮膚的單獨或多發(fā)的單核細胞浸潤為特征[1]。該病具有高度傳染性，也是一種免疫抑制性疾病[2]。

MDV在細胞培養(yǎng)條件下呈一種嚴格細胞結(jié)合狀態(tài)，MD的病原是在1967年由Churchill和Biggs．通過體外增殖和后來從MD腫瘤細胞分離獲得皰疹病毒才得以確定的。目前，將MDV毒株分為3個血清型。其中，引起腫瘤的MDV毒株被歸為l型，天然不致瘤的MDV為2型，而HVT毒株為3型[3]。

目前，采用免疫雞群攻毒保護試驗來判定MDV毒力的強弱，將血清l型MDV分為四種病原型，即溫和型（mMDV）、強毒型（vMDV）、超強毒型（vvMDV）、特超強毒型（vv+MDV），其中每種致病型都有特定的臨床癥狀[4]。

MD是目前已知的唯一可用疫苗成功預(yù)防的病毒性腫瘤病，因而在比較醫(yī)學(xué)上，它是研究病毒性腫瘤的發(fā)生和預(yù)防機制的理想的動物模型。MDV是一群細胞結(jié)合型的皰疹病毒科的成員，在感染細胞內(nèi)可見85～l00 nm的無囊膜病毒粒子，稱為核衣殼。MDV的基因組成雙股線形DNA，長度約為180 kb，裸露的病毒DNA對單層細胞和易感雞都有感染性。MD的發(fā)生和嚴重程度，取決于病原、宿主和環(huán)境，這3者密切相關(guān)[5]。

本病無特效藥物治療，只能依靠免疫預(yù)防。也許只有時間才能告訴我們目前家禽業(yè)所采取的措施能否會給發(fā)生突變的MDV得以逃逸及增強其毒力的機會[7]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病料 撫順地區(qū)某農(nóng)戶送檢的病死雞5只。

1.1.2 試劑 MD陽性血清、MD沉淀抗原、甲醛、酒精（95%）、二甲苯、石蠟、甘油、蘇木素、鉀明礬、鉀明礬、曙紅、NACL。

1.1.3 實驗儀器 顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱、切片機、水浴鍋、座式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、微量移液器、電爐、平皿、架盤藥物天平、砝碼、藥匙、量筒、燒杯、玻璃棒、紗布、漏斗、毛刷、剪子、手術(shù)刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、木塊、廢液缸、酒精燈、濾紙、樹膠、新鮮蛋白等。

1.1.4 瓊脂擴散試驗平板制作 首先稱取1g瓊脂粉，加至100mL8.5% 的高滲鹽水中，煮沸使之溶解（在電爐子上加熱，邊加熱邊攪拌，直到溶液由渾濁變澄清為止）。然后待溶解的瓊脂溫度降至55℃左右時，將其倒入滅菌清潔的平皿中，厚度約2 mm。在瓊脂凝固后，用打孔器在瓊脂凝膠上打梅花孔。一般的打孔器有 7個孔，中心孔孔徑為3 mm，周邊孔孔徑為3ml，孔距為3 ml?？變?nèi)的瓊脂如未吸出，則用注射器針頭挑出。最后將平皿在酒精燈上烘烤背面（溫度不宜過高，以不燙手為宜）使瓊脂與平皿貼緊。

1.1.5 試劑配制

固定液配制：福爾馬林液

福爾馬林（37%-40%甲醛）：100 ml 常水：500 ml蘇木素染液：

第1液配方：蘇木素1 g、無水酒精10 ml。第2液配方：鉀明礬 20 g、蒸餾水200 ml。

第1液和第2液分別配制，第2液經(jīng)過過濾后加入第1液中，盛染液的瓶口蓋上紗布，置應(yīng)用于日光下照射約2周，經(jīng)過過濾后可以使用。

伊紅水溶液的配制：伊紅（水溶性）1 g、蒸餾水100 ml， 混合后溶解即可應(yīng)用，密封保存。

1%鹽酸酒精液的配制：70%的酒精100 ml、濃鹽酸1 ml。

1.2 實驗方法

1.2.1 病理剖檢

將送檢的病例進行尸體剖檢，外部檢查之后用清水將禽體羽毛浸濕，切開大腿與腹側(cè)連接的皮膚，用力將兩大腿向外翻壓直到兩髖關(guān)節(jié)脫臼，使禽體背臥位平躺。在泄殖孔前的皮膚作一條橫切線，由此切線中部沿腹中線由后向前剪開皮膚，直到喙角，使腹部和胸部皮膚分離，進行臨床剖檢診斷。

在對臨床癥狀、尸體剖檢的基礎(chǔ)上，從待檢雞的背部、翅尖、尾尖拔取含有羽髓豐富的羽毛供實驗室檢驗，以尋求確診。

1.2.2 瓊脂擴散試驗

采集羽髓：從被檢雞的羽毛豐厚處拔下羽毛，從羽根尖端剪下1 cm左右的一段，注意要露出羽髓。

加樣：取瓊脂平板1個，將瓊脂平板6個孔編號，分別取5根露出羽髓的羽根，直接將其插入外周1、2、3、4、5孔中，外周的第6孔中用微量移液器加入MD標準抗原，向中心孔中加入標準陽性血清。然后將加樣完畢的瓊脂板加蓋平放于帶蓋的濕盒內(nèi)，置37℃溫箱中，24 h內(nèi)觀察結(jié)果。

結(jié)果判定：被檢材料與中心陽性血清空之間形成清晰的沉淀線則判為陽性，否則即為陰性。

1.2.3 病理組織學(xué)觀察

取材固定；脫水透明；浸蠟包埋；切片貼片；修整展片；H·E染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理解剖學(xué)變化

組織器官：皮膚表面出現(xiàn)多個、大小不等的、灰白色的腫瘤結(jié)節(jié)；心臟：表面有大小的灰白色結(jié)節(jié)，稍突出于心臟表面；肝臟：明顯腫大，表面有白色小結(jié)節(jié)；脾臟：彌散性腫大；腎臟：彌漫性腫大并呈灰白色；腺胃壁：增厚?？蓞⒖紙D1所示變化。

圖1 肝臟明顯腫大，表面有白色腫瘤結(jié)節(jié)

2.2 瓊脂擴散試驗

羽髓瓊脂擴散試驗結(jié)果詳見圖2。

從圖2可以看出，外周2、3、4、5、6孔的羽髓與中央的陽性血清之間均形成清晰的灰白色沉淀線，證明2、3、4、5這4根羽髓的AGP試驗為陽性，1孔未形成沉淀線，為AGP試驗陰性，而6孔為標準陽性抗原對照，檢測結(jié)果也為陽性。

圖2 瓊脂擴散試驗結(jié)果

2.3 病理組織學(xué)觀察

2.2.1 心臟 心肌纖維顆粒變性、水泡變性。在血管周圍、肌纖維間、心外膜下有淋巴細胞呈浸潤性增生。肌纖維脂肪變性，局部蠟樣壞死。

2.2.2 脾臟 鞘動脈周圍、淋巴小結(jié)出現(xiàn)大量淋巴細胞、網(wǎng)狀細胞。淋巴細胞核碎裂、邊集，并見核分裂相。

2.2.3 肝臟 肝細胞顆粒變性、水泡變性、部分壞死。竇周隙狹窄，散在少量的紅細胞和淋巴細胞，狄氏隙擴張。中、小淋巴細胞、網(wǎng)狀細胞在靜脈周圍浸潤。在肝小葉內(nèi)局灶性增生。增生灶內(nèi)有呈空泡狀的原始網(wǎng)狀細胞和核邊集的凋亡淋巴細胞。肝細胞壞死處有淋巴細胞集聚（詳見圖3）。

2.2.4 腎臟 腎小球體積增大。腎小囊腔狹窄。并有血紅蛋白樣物質(zhì)。腎小囊壁上皮細胞腫脹。局部腎小球萎縮，出現(xiàn)代償性增大。腎小管上皮細胞從顆粒變性、水泡變性到細胞壞死、胞膜破裂，整個腎小管呈均質(zhì)紅染。腎小管內(nèi)有血紅蛋白樣物質(zhì)，呈尿管型（詳見圖4）。

2.2.5 坐骨神經(jīng) 神經(jīng)纖維間水腫液內(nèi)散在中小淋巴細胞及漿細胞。局部灶性增生。

2.2.6 卵巢 皮質(zhì)和髓質(zhì)見有結(jié)節(jié)性或彌漫性網(wǎng)狀細胞、淋巴細胞集聚。淋巴細胞核顯分裂相，局灶性增生細胞排列呈渦漩狀。部分卵泡全部被多形態(tài)淋巴細胞所代替。

2.2.7 腺胃 腺小管腺細胞開始呈顆粒變性、水泡變性，逐漸壞死，腺小管內(nèi)散在流失的胞漿。淋巴細胞和網(wǎng)狀細胞在腺小管間、肌層間、漿膜下浸潤和增生。

2.2.8 十二指腸 肌層肌細胞和腸絨毛上皮細胞變性、壞死。漿膜、漿膜下、肌層、腸腺間和絨毛固有層出現(xiàn)不同程度的大中小淋巴細胞浸潤和增生。腸腺間有網(wǎng)狀細胞增生。

2.2.9 肺 血管內(nèi)、外散在淋巴細胞。血管周圍肺小葉間隔有少量的淋巴細胞浸潤，局部肺泡間隔及支氣管周圍充滿大量的大中小淋巴細胞、少量的網(wǎng)狀細胞。肺小葉內(nèi)充滿淋巴細胞、紅細胞，局部實質(zhì)內(nèi)全被腫瘤細胞代替。

圖3 肝細胞管內(nèi)有多形態(tài)的淋巴細胞浸潤

圖4 腎小管之間見數(shù)量不等淋巴細胞浸潤

3 結(jié)論與討論

3.1 羽囊瓊脂擴散試驗

3.1.1 試驗原理 羽囊瓊脂擴散試驗是沉淀反應(yīng)試驗的一種，以瓊脂凝膠作為載體，在1%以下的瓊脂凝膠中可形成大于85 nm的微孔，可溶性抗原或抗體能在其中自由擴散，并由近及遠形成濃度梯度。抗原和抗體在比例適當處相遇，形成顆粒較大的抗原-抗體復(fù)合物而不再擴散，出現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀線。一種抗原抗體系統(tǒng)只出現(xiàn)一條沉淀線，復(fù)合抗原中的多種抗原抗體系統(tǒng)均可以根據(jù)自己的濃度、擴散系數(shù)、最適比等因素，形成自己的沉淀線。

3.1.2 試驗特點 羽囊瓊脂擴散試驗不需要精密的儀器且操作簡單，技術(shù)上易掌握，在我國目前條件下比熒光抗體技術(shù)和免疫電泳等易于在基層獸醫(yī)站或檢驗室推廣應(yīng)用。羽囊瓊脂擴散試驗所形成的沉淀線不但易于攝影記錄，并可經(jīng)染色后做永久標本。在與補體結(jié)合試驗的比較中，羽囊瓊脂擴散試驗的陽性檢出率要高于補體結(jié)合試驗；應(yīng)用本試驗可以在同一個平皿中同時檢測多種抗原或抗體，并可就反應(yīng)后形成沉淀線的多少來辨識抗原是否純凈，因此適用于分析多種抗原成分的材料。應(yīng)用瓊脂擴散試驗的缺點是試驗過程中容易出現(xiàn)假陽性。

3.1.3 注意事項 應(yīng)多拔幾根新羽來檢查；加樣時，以把孔加滿為度，切忌樣品溢出，影響判定結(jié)果；與鄰接孔連片時應(yīng)作廢處理；MD陽性血清避免反復(fù)凍融，以防降低效價而影響檢出結(jié)果；在瓊脂擴散試驗時，還要注意羽囊同時緣孔緊密吻合，防止羽囊徑小，邊緣孔大，否則抗原擴散不充分，降低查檢率。

3.2 病理組織學(xué)觀察

3.2.1 組織固定 用于組織固定的材料必須新鮮，采集和分割后要立刻固定，不得延誤；固定材料體積的大小，以不超過直徑5 mm為準，材料與固定液的比例，以1∶20為準；所用固定液以新配的為好，并放置在陰涼處，不要在日光下直曬；材料固定完畢后，必須在容器外貼上標簽，以防止相互混淆。

3.2.2 組織脫水 組織脫水是在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體；在高濃度酒精中，每級停留時間也不宜太長，否則可使組織收縮變脆，影響切片；脫水應(yīng)徹底干凈，否則與二甲苯混合后，將呈乳白色渾濁，雖然可以倒回重脫，但效果不好；如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中。

3.2.3 組織塊透明 組織塊透明時要注意二甲苯極易揮發(fā)，故在切片透明之后，從染色缸中取出封藏，手續(xù)要敏捷，不宜久置，否則待二甲苯揮發(fā)干凈后，組織就會變硬發(fā)白，即使再加樹膠封藏，由于樹膠不能浸入組織，封后也無用處；二甲苯極易吸收空氣中的水分，故在濕度大的天氣，貯有二甲苯的染色缸的蓋子周緣可涂少許凡士林，以防止水分的滲入。在封片時也不宜將口鼻過分靠近切片，以免水氣侵入，出現(xiàn)白色云霧狀；二甲苯必須保持無水無酸。若用1～2滴石蠟油滴入其中，立即出現(xiàn)云霧狀，即表示其中已含有水分，不能再用。

3.2.4 石蠟切片制作 檢驗過程中，石蠟切片制作出現(xiàn)了材料裂隙、破碎的情況，請做類似試驗時借鑒。

3.6 結(jié)論

（1）本試驗對一起疑似馬立克氏病的病死雞進行臨床剖檢診斷，初步確診為雞馬立克氏病。

（2）在臨床診斷的基礎(chǔ)上又進行了羽囊瓊脂擴散試驗和病理組織學(xué)診斷。瓊脂擴散試驗結(jié)果表明，被檢的5份病料中，4分為陽性，1份為陰性。

（3）通過對病雞的各臟器進行病理組織學(xué)觀察檢測結(jié)果表明，各臟器具備典型的馬立克氏病的病理組織學(xué)變化。

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