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      廣西防城港首次截獲苜蓿黃萎病菌

      2012-08-27 00:42:04黃勝光盧兆山邱世明奚國華鐘恒祿
      植物保護(hù) 2012年1期
      關(guān)鍵詞:苜蓿草黃萎病分生孢子

      黃勝光, 盧兆山, 邱世明, 奚國華, 陸 道, 鐘恒祿

      (廣西防城港出入境檢驗檢疫局,538001)

      廣西防城港首次截獲苜蓿黃萎病菌

      黃勝光, 盧兆山, 邱世明, 奚國華, 陸 道, 鐘恒祿

      (廣西防城港出入境檢驗檢疫局,538001)

      從一批進(jìn)境的美國苜蓿草樣品中保濕分離得到了3株與苜蓿黃萎病菌(Verticillium albo-atrum)相似的目標(biāo)菌VA1、VA2、VA3。該目標(biāo)菌在PDA上生長迅速,菌絲生長0.8~1.0mm/d,2~3d即可生成肉眼可見的菌落斑點(diǎn);菌落為白色圓形,邊緣規(guī)則呈圓形,菌絲較致密,氣生菌絲較少,菌落中心乳白色奶凍狀;培養(yǎng)4~5d即后產(chǎn)生氣生典型輪枝狀分生孢子梗,7~8d后菌落中央表面因產(chǎn)生休眠菌絲開始變成黑褐色至黑色,20d后菌落的表面和背面大部分均變黑色,仍不產(chǎn)生微菌核和厚垣孢子。該目標(biāo)菌的純培養(yǎng)用V.albo-atrum特異引物Vaa1/Vaa2進(jìn)行檢測,PCR擴(kuò)增后得到預(yù)期330bp的產(chǎn)物片段,產(chǎn)物序列與V.albo-atrum相應(yīng)序列的相似性為100%。從而鑒定確認(rèn)該目標(biāo)菌為苜蓿黃萎病菌V.albo-atrum。

      苜蓿黃萎病菌; 檢疫; 口岸截獲

      致 謝: 目標(biāo)菌純培養(yǎng)送至江蘇出入境檢驗檢疫局,由吳翠萍、李彬復(fù)核確認(rèn),特此致謝。

      聯(lián)系方式 Tel:0770-2822708;E-mail:gxhsg@163.com

      輪枝菌的2個最重要植物寄生菌就是苜蓿黃萎病菌(Verticillium albo-atrum)和棉花黃萎病菌(V dahliaeKlebahn)[1]。其中苜蓿黃萎病菌危害大、致病力強(qiáng)是我國檢疫性真菌病害。此病最早于1918年發(fā)現(xiàn)于瑞典Hedlund,1923年-1950年基本遍布整個北歐[2],1977年美國第一次報道發(fā)現(xiàn)苜蓿黃萎病菌[3],從此此病在美國快速擴(kuò)展,成為許多地方苜蓿種植的一個重要限制因素[4-5]。

      2010年10月下旬,防城港檢驗檢疫局受理報檢了一批從美國進(jìn)口的苜蓿草,該批貨物共5個集裝箱,重量118.6t,貨值3.38萬美元。檢驗檢疫人員對該批貨物實施了現(xiàn)場查驗、抽樣。樣品經(jīng)實驗室保濕培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)疑似苜蓿黃萎病菌,分離純化后獲得的純培養(yǎng),觀察和測量其形態(tài)特征,同時通過PCR檢測以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序與基因庫比對分析,確認(rèn)該批貨物含有我國禁止進(jìn)境植物檢疫性有害生物——苜蓿黃萎病菌(V.albo-atrum)。發(fā)現(xiàn)疫情后,該局根據(jù)相關(guān)規(guī)定及時出具了《檢驗檢疫處理通知書》,對該批貨物已作監(jiān)督退運(yùn)處理?,F(xiàn)將檢疫鑒定結(jié)果報道如下。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      美國進(jìn)境紫花苜蓿干草樣品,試驗樣品重量為5袋計5kg,陽性對照為V.albo-atrumM1菌株(由江蘇出入境檢驗檢疫局吳翠萍女士提供)。

      1.2 樣品保濕培養(yǎng)

      盡可能地挑取枯黃的莖稈以及維管束褐變的莖稈樣品,每根莖稈剪取一段,約長4cm,共剪取100根,加入1%次氯酸鈉溶液,消毒1min,取出用無菌水漂洗3~4次,分別均勻擺放到15套滅菌9cm培養(yǎng)皿中,置于24℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)。

      1.3 疑似目標(biāo)菌的觀察

      保濕培養(yǎng)7d后在體視鏡下逐根觀察苜蓿草莖稈段,觀察有無典型輪生樹枝狀分生孢子梗產(chǎn)生。

      1.4 目標(biāo)菌的形態(tài)學(xué)鑒定

      用接種針沾下分生孢子梗頂端的孢子團(tuán),在含青霉素的培養(yǎng)基上畫線分離培養(yǎng),進(jìn)一步進(jìn)行單孢分離而獲得純培養(yǎng)。觀察單孢分離培養(yǎng)后菌落生長的形態(tài)、菌絲特征,以及分生孢子梗和分生孢子,有無休眠菌絲、厚垣孢子、微菌核產(chǎn)生等情況。

      1.5 目標(biāo)菌純培養(yǎng)的PCR檢測

      取疑似目標(biāo)菌絲純化后液氮研磨提取DNA,取1μL為模板。試驗采用V.albo-atrum特異性引物Vaa1: 5′-CCGGTACATCAGTCTCTTTA-3′ 和Vaa2:5′-CTCCGATGCGAGCTGTAAT-3′ 進(jìn) 行PCR檢測[6],預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為330bp,引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

      PCR反應(yīng)體系為:premix 15μL,10μmol/L、下游引物Vaa01/Vaa2各1μL,模板DNA 1μL,TaqDNA聚合酶0.25μL,以滅菌超純水補(bǔ)足總體積至30μL。陽性對照模板為菌株M1的DNA,陰性對照模板為超純水。反應(yīng)程序為:94℃變性5min;進(jìn)入循環(huán),95℃變性30s,64℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。

      取20μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳,GEL RED染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。

      2 結(jié)果

      2.1 目標(biāo)菌的發(fā)現(xiàn)

      在體視鏡下觀察所有100根苜蓿草莖稈段,發(fā)現(xiàn)其中3根有典型輪生樹枝狀的分生孢子梗產(chǎn)生,分生孢子梗直立,梗上每節(jié)輪生2~4個小梗,在小梗頂端產(chǎn)生分生孢子團(tuán)(圖1a)。

      圖1 苜蓿黃萎病菌的形態(tài)鑒定

      2.2 目標(biāo)菌形態(tài)學(xué)的觀察與測量

      用接種針在苜蓿草段的分生孢子梗頂端的孢子團(tuán)沾一下,分別在含青霉素的PDA上畫線分離,約培養(yǎng)20h分生孢子即開始萌發(fā),用接種鏟挑取萌發(fā)的單孢進(jìn)行培養(yǎng)而獲得純培養(yǎng)。對這3根苜蓿草段上分生孢子分離而獲得的純培養(yǎng)分別編號為VA1、VA2、VA3。

      目標(biāo)菌在PDA上生長迅速,菌絲生長0.8~1.0mm/d,2~3d即可生成肉眼可見的菌落斑點(diǎn)。菌落邊緣規(guī)則呈圓形或近圓形,菌絲較致密,氣生菌絲較少,菌落中心乳白色奶凍狀(圖1b)。初期主要產(chǎn)生生長于培養(yǎng)基下的營養(yǎng)菌絲,4~5d后產(chǎn)生典型的氣生輪枝狀分生孢子梗,可見二次分枝,有隔、無色至淡色,梗上每節(jié)輪生2~4個小梗,小梗大小為(21~45)(~64)μm×(1.5~3.5)μm,平均大小為33.14μm×2.18μm。分生孢子橢圓形、圓筒形,無色,單孢,少數(shù)孢子1隔,大小為(2.5~12.5)(~16)μm×(2~4.5)μm,平均大小為6.88μm×3.22μm(圖1c)。培養(yǎng)7~8d后菌落中央因產(chǎn)生休眠菌絲開始變成黑褐色,休眠菌絲黑暗褐色至黑色(圖1d),直徑3~9μm,分隔規(guī)則,隔膜間膨大,胞壁增厚,呈念珠狀,有時集結(jié)成菌絲結(jié)或瘤狀菌絲體,培養(yǎng)20d不產(chǎn)生厚垣孢子和微菌核。據(jù)此,該目標(biāo)菌的形態(tài)特征基本與有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)描述的苜蓿黃萎病菌相吻合[7]。

      2.3 PCR檢測結(jié)果

      對分離得到的目標(biāo)菌株純培養(yǎng)用V.albo-atrum的特異性引物Vaa1/Vaa2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,3個菌株均呈PCR陽性。

      圖2 目標(biāo)菌株純培養(yǎng)PCR檢測電泳圖

      2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序與基因庫比對分析

      測序所得333bp長序列,經(jīng)GenBank(NCBI)Blast分析(表1)表明,序列和X60705、GU291258、GQ495790、GQ336791等17個菌株登記序列100%相同,與Z29510、Z29509、GQ495792等33條序列有3個堿基的差異。

      表1 菌株測序所得序列與GenBank(NCBI)已有苜蓿黃萎病菌序列Blast比對表

      綜上所述,鑒定該批苜蓿草帶有我國禁止進(jìn)境的檢疫性病菌——苜蓿黃萎病菌(V.albo-atrumReinke et Berthold)。這是防城港檢驗檢疫局首次截獲該菌。

      3 討論

      近年來,我國從美國進(jìn)口苜蓿草呈大幅增長的趨勢,2007年不足1萬t,2009年為7.6萬t,而2010年高達(dá)22.72萬t。苜蓿黃萎病菌是我國重要的進(jìn)境檢疫性病菌,不僅對苜蓿草造成危害,還會對啤酒花、蛇麻草、花生和馬鈴薯等多種園藝作物及經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重危害[8];該病菌可通過昆蟲、水流、風(fēng)、收割機(jī)械、花粉等近距離傳播[9-13],通過干草、種子、塊莖及病殘體等進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播[14],因此來自苜蓿黃萎病發(fā)生區(qū)的苜蓿飼草傳帶苜蓿黃萎病的風(fēng)險很高。同時我國當(dāng)前苜蓿生產(chǎn)主栽品種多為感病品種,該病菌在我國的適生性強(qiáng),特別在我國西北、東北以及華北地區(qū)的苜蓿種植區(qū)適生程度處于較高水平[15]。一旦苜蓿黃萎病傳入定殖蔓延,對苜蓿生產(chǎn)將造成毀滅性打擊。因此,各口岸必須加強(qiáng)檢疫,嚴(yán)防該病的傳入與傳播。

      本試驗培養(yǎng)的苜蓿黃萎病菌形態(tài)學(xué)上與其相似的輪枝孢屬近似種V.dahliae、V.nigrescens、V.nubilum和V.tricorpus相比,在分生孢子梗長度、輪生小梗數(shù)目、小梗和分生孢子的大小之間有差別也有交疊[16-20],但 由 于V.dahliae在 PDA 上 培 養(yǎng) 10~14d后產(chǎn)生黑色微菌核,V.nigrescens產(chǎn)生黑褐色厚垣孢子,V.nubilum亦生黑褐色厚垣孢子,V.tricorpus產(chǎn)生休眠菌絲、微菌核和厚垣孢子[21],而苜蓿黃萎病菌只產(chǎn)生休眠菌絲不產(chǎn)生微菌核和厚垣孢子;同時本試驗還通過設(shè)計特異性引物對該菌進(jìn)行PCR檢測,因而較容易將苜蓿黃萎病菌與這幾個近似種區(qū)別開來。

      本試驗采用莖稈保濕培養(yǎng)法,可直接在體視鏡下觀察到疑似目標(biāo)菌分生孢子梗和分生孢子團(tuán),實踐中作者嘗試過直接用挑針沾取這些分生孢子團(tuán)進(jìn)行PCR檢測,效果很好。實際工作中可以將目標(biāo)菌分離純化和PCR檢測同步進(jìn)行,以便進(jìn)一步縮短檢測時間。

      本試驗從樣品保濕培養(yǎng)7~9d、目標(biāo)菌分離純化4~5d、PCR檢測2~3d、直到最后結(jié)果確認(rèn)所需時間在13~17d,而目前行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《苜蓿黃萎病檢疫鑒定方法》SN/T 1145—2002中保濕培養(yǎng)需20d、還有分離純化、致病性檢測等,這樣時間會拉得很長,遠(yuǎn)不能適應(yīng)當(dāng)今國際貿(mào)易的需求。建議國家質(zhì)檢總局盡快組織專家對該行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂。

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      [18]Hawksworth D L.Verticillium nigrescens[M]∥ CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria,No.257.Wallingford,UK:CABI Publishing,1970.

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      First interception ofVerticillium albo-atrumin Fangchenggang of Guangxi

      Huang Shengguang, Lu Zhaoshan, Qiu Shiming, Xi Guohua, Lu Dao, Zhong Henglu
      (Fangchenggang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangxi538001,China)

      Three strains of the fungus,namely VA1,VA2 and VA3,were isolated from a batch of alfalfa samples,which were imported from USA and incubated under moist conditions,demonstrating the characters similar toV.albo-atrum.The strains grew rapidly on the PDA,with the colony growing at 0.8-1.0mm/d.After 2-3 days,the spot colony could be seen on the PDA.In addition,the colony had a regular and rounded margin with white compact mycelium and fewer aerial mycelia.The target fungus produced typical round aerial branched conidiophores after 4-5 days,and then became dark brown to black along with production of resting hyphae at the centre of the colony after 7-8 days,and the color of the surface and most of the back of the colony changed to black 20 days later,but still could not produce micro-sclerotia and chlamydospores.The pure cultures of the target germ were detected by the specific primers Vaa1/Vaa2.As expected,a330 bp fragment was obtained by PCR amplification.The similarity between the product and corresponding sequence inV.albo-atrumwas 100%.Therefore,it was confirmed that the target germ wasV.albo-atrum.

      Verticillium albo-atrum; inspection; interception at port

      S 435.4

      B

      10.3969/j.issn.0529-1542.2012.01.040

      2011-04-29

      2011-05-15

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