豬圓環(huán)病毒2型膠體金抗體檢測方法的建立

張文通，魏 鳳，王金良，肖躍強(qiáng)，沈志強(qiáng),

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

豬圓環(huán)病毒 2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（Postweaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原[1-2]。PMWS主要發(fā)生于5周～12周的斷奶仔豬，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、呼吸道癥狀、發(fā)熱、蒼白及黃疸等。病原學(xué)及血清學(xué)調(diào)查表明，該病在許多國家廣泛存在，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立一種PCV2抗體的快速檢測方法，為該病的預(yù)防提供依據(jù)十分重要。

PCV2包括兩個主要的開放閱讀框：ORF1和ORF2；ORF2編碼的Cap蛋白是PCV2主要結(jié)構(gòu)蛋白。Truong等研究表明，ORF2抗原表位可以作為PCV2實(shí)驗(yàn)豬及自然感染豬血清學(xué)檢測的標(biāo)志[3]。目前診斷PCV2的血清學(xué)方法主要有ELISA、免疫酶組織化學(xué)染色法和免疫熒光等方法。但這些方法由于費(fèi)時或成本高等因素的制約，只能用于實(shí)驗(yàn)室的診斷，不適合大量樣品的檢測。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，根據(jù)免疫層析原理，用膠體金標(biāo)記葡萄球菌蛋白A（SPA）作為探針，用純化的重組ORF2蛋白和健康豬IgG分別作為檢測線和對照線試劑，研制一種PCV2抗體膠體金試紙條。該試紙條具有檢測快速和使用方便等優(yōu)點(diǎn)，可以適用于臨床樣品的大量檢測，為PCV2抗體檢測提供了有效的工具。

1 材料和方法

1.1 病毒株、重組菌及血清 SPA購自Prospec公司；豬圓環(huán)病毒抗體檢測ELISA試劑盒、pKGORF2/BL21重組菌以及豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬瘟病毒（HCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、PCV2免疫血清均由濱州畜牧獸醫(yī)研究院制備保存。

1.2 主要材料與儀器 硝酸纖維素膜、玻璃纖維墊、吸收墊及背襯等層析材料購自M illipore公司；GST標(biāo)簽蛋白親和層析純化柱為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品；BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；ZX1000噴點(diǎn)平臺系統(tǒng)、CM 4000試紙條切刀為美國Biodot公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡為Tokyo產(chǎn)品。

1.3 純化重組ORF2蛋白的制備 將pKG-ORF2/BL21菌于500 ML液體LB培養(yǎng)基中37℃搖菌培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)0.6時，加IPTG至終濃度為1.0mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h；8 000 r/m in離心10 Min，沉淀用1/10體積緩沖液A（Tris-Cl 50m M/L、EDTA 0.5 mM/L、NaCl 50 mM/L、Glycerol 5%（W/V））重懸，添加DTT至終濃度為10 mmol/L，超聲波破碎。4℃條件下12 000 r/m in離心10 Min。沉淀中加入19.7 ML緩沖液A及0.3 ML 20%SKL貯存液，攪動溶解，靜置 30 min～2 h，4℃ 12 000 r/m in離心 10 Min，取上清，加入20%PEG 4 000至終濃度為0.2%，加50mmol/L的氧化型谷胱苷肽至終濃度為1mmol/L，加100mmol/L的還原型谷胱苷肽至終濃度為2mmol/L，靜置30 min～2h，PBS透析2 d～3 d，將上清濃縮至5 ML，按GST標(biāo)簽蛋白親和層析純化柱說明書進(jìn)行純化，得到純化的重組ORF2蛋白。BCA法測定蛋白濃度。

1.4 膠體金及金標(biāo)SPA的制備 參照文獻(xiàn)[4]并稍作優(yōu)化，取100 ML三蒸去離子水于平底燒瓶中，加入2m L預(yù)先配制的1%氯金酸溶液，在恒溫磁力攪拌器上加熱沸騰，快速攪拌下迅速加入1.8 ML 1%檸檬酸三鈉溶液，待溶液變?yōu)槠咸丫萍t色后再加熱15m in。自然冷卻至室溫，三蒸水定容后，0.1mol/mL K2CO3調(diào)節(jié)pH6.5。將20 ML膠體金快速攪拌下緩慢加入200μL（1mg/mL）SPA蛋白，持續(xù)攪拌30min后，加入2.5m L 10%BSA溶液，繼續(xù)攪拌30min。4℃8 700 r/min離心45 Min，沉淀用含0.5%PEG 20 000的0.005 mol/L PBS（pH7.2）重懸至原量，10 000 r/min重復(fù)離心2次，用1 ML含1%BSA的0.01mol/L PBS（pH7.2）重懸沉淀，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 金標(biāo)快速檢測試紙條的組裝 試紙條由樣品墊、金標(biāo)SPA結(jié)合墊、NC膜和吸水墊4部分組成。首先將樣品墊（玻璃纖維）和金標(biāo)抗體結(jié)合墊（玻璃纖維）用含有2%BSA、2.5%蔗糖、1%吐溫20、0.3%PVPk30以及0.02%疊氮鈉的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）封閉，于37℃溫箱中干燥。采用點(diǎn)膜儀將金標(biāo)SPA噴涂于玻璃纖維上，噴涂量為12μL/cm，抽真空干燥。采用點(diǎn)膜儀分別將2 mg/mL豬IgG和1mg/mL純化重組ORF2蛋白噴涂于NC膜上，間隔1 cm，作為檢測線和質(zhì)控線，37℃溫箱中干燥1 h。最后將樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、NC膜和吸水紙依次粘貼在塑料底板上，切割成3.5 mm寬的試紙條，密封后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 檢測方法及結(jié)果判定 將試紙條插入到含100μL樣品的加樣孔中，10m in內(nèi)判定結(jié)果。檢測線上出現(xiàn)紅色條帶為陽性；檢測線上無紅色條帶為陰性；質(zhì)控線無條帶則試紙條無效。

1.7 試紙條的批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn) 對同批和不同批次的試紙條分別進(jìn)行特異性及靈敏度試驗(yàn)，觀察其重復(fù)性。

1.8 試紙條穩(wěn)定性試驗(yàn) 將試紙條存放于室溫，每30 d檢測標(biāo)準(zhǔn)陽性及陰性樣品，觀察其特異性以及靈敏度的變化。

1.9 臨床樣品檢測 采用制備的膠體金試紙條檢測320份臨床豬血清樣品。PCV2抗體膠體金試紙條的使用方法：將血清樣品以樣品稀釋液（0.85%生理鹽水）稀釋100倍，將試紙條插入進(jìn)行檢測，10m in內(nèi)判斷結(jié)果。同時以ELISA方法同時檢測作為對照。

2 結(jié)果

2.1 重組ORF2蛋白的制備及純化 將重組ORF2蛋白制備并純化后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，蛋白大小約為45 ku，并且具有較高的純度（圖1）。蛋白濃度為1.592mg/mL。

圖1 重組ORF2蛋白純化的SDS-PAGE結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE results of purified recombinant ORF2 protein

2.2 膠體金制備及鑒定 制備的膠體金外觀呈葡萄酒紅色。透射電鏡觀察，膠體金顆粒大小形狀均勻，分散，顆粒直徑約為20 nm（圖2）。

圖2 膠體金的電鏡照片F(xiàn)ig.2 TEM image of collidal gold particles

2.3 特異性試驗(yàn) 采用制備的試紙條對0.85%生理鹽水以及 PCV2、HCV、PRV、PPV、PRRSV、PEDV免疫血清進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn)。結(jié)果顯示PCV2免疫血清呈陽性反應(yīng)，而0.85%生理鹽水及其他血清均呈陰性反應(yīng)（圖3），表明該方法具有高度的特異性。

圖3 試紙條特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity of the immunochromatographic strip

2.4 敏感性試驗(yàn) 以0.85%生理鹽水倍比稀釋PCV2免疫血清并進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示當(dāng)稀釋至1∶1 280時，結(jié)果仍呈陽性，而1∶2 560時呈陰性（圖4）。

2.5 重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn) 對不同批次的PCV2抗體檢測試紙條進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，符合率為100%。室溫下保存6個月，其特異性及靈敏度無任何變化。

2.6 臨床樣品檢測 用試紙條對臨床采集的324份血清樣品進(jìn)行檢測，同時以ELISA試劑盒檢測作為對照，試紙條檢出率為88.58%，而ELISA試劑盒為89.20%，兩者的符合率為98.77%（表1）。

表1 臨床血清樣品檢測結(jié)果Table1 Clinical application of ELISA and Strips

3 討論

本研究利用膠體金為示蹤物，SPA蛋白和重組ORF2蛋白間接法研制了PCV2抗體膠體金試紙條。通過對PCV2陽性血清樣品的比較測定，試紙條所測得的抗體滴度比ELISA低1個～2個滴度，而與豬其他病毒的免疫血清無交叉反應(yīng)。試紙條在室溫存放4個月，特異性和敏感性無任何變化，表明其具有高度穩(wěn)定性。對臨床采集血清樣品陽性檢出率為88.58%，與ELISA試劑盒總符合率為98.77%。由此表明，本研究研制的試紙條具有特異、敏感、穩(wěn)定等特點(diǎn)。

與目前PCV2的血清學(xué)診斷方法相比，本研究建立的試紙條快速、準(zhǔn)確、靈敏，可以憑肉眼在10min內(nèi)判定結(jié)果，操作簡單，普通的養(yǎng)殖戶即可現(xiàn)場使用。該方法可以用于大批量、大范圍的PCV2抗體調(diào)查。

本研究建立了PCV2抗體膠體金免疫層析檢測方法，研制的試紙條對PCV2抗體具有很高的特異性和敏感性。臨床應(yīng)用表明試紙條使用方便、快捷并且操作簡單，適合對PCV2抗體進(jìn)行現(xiàn)場檢測。該方法的建立為PCV2流行病學(xué)調(diào)查及預(yù)防控制奠定了基礎(chǔ)。

[1]Allan G M,Mcneilly F,Kennedy S,et al.Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs w ith a wasting disease in the USA and Europe[J].JVet Diagn Invest,1998,10（1）:3-10.

[2]Allan G M,Meehan B,Todd D,et al.Novel porcine circoviruses from pigs with wasting disease syndromes[J].Vet Rec,1998,142:467-468.

[3]Truong C A,A lbina E.Identification of an immunorelevant ORF2 epitope from porcine circovirus type 2 as a serolofical marker for experimental and natural infection[J].Arch Virol,2001,146:1197-1211.

[4]Grabar K C,Griffith F R,Hommer MB,et al.Preparation and characterization of Au colloid monolayers[J].Anal Chem,1995,67（4）:735-743.