宋建領(lǐng)，張富強，李華春*，楊仕標，王金萍

（1.云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224；2.成都軍區(qū)疾病預防控制中心，云南昆明 650032）

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（AIV）引起的一種禽類的感染性疾病綜合征。近年來，H5N1和H9N2亞型AIV的暴發(fā)，特別是H5N1亞型AIV突破種間屏障感染人的病例[1]，賦予AI全新的公共衛(wèi)生意義。AIV屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒成員。AIV基因組由8個節(jié)段的單股負鏈RNA組成，編碼10種病毒功能蛋白。病毒第7節(jié)段RNA轉(zhuǎn)錄過程中，經(jīng)剪接、編輯合成兩條不同的mRNA，翻譯合成M 1和M 2基質(zhì)蛋白。M 1是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白由252個氨基酸殘基組成，分子量約26 ku，占病毒蛋白總量的30%～40%。該蛋白具有型特異性，其抗原性差異是流感病毒分型的依據(jù)之一。M 1在病毒復制中還具有重要的調(diào)節(jié)功能[2]，如控制病毒的轉(zhuǎn)錄和被感染細胞的胞核胞漿之間的物質(zhì)運輸[3]。研究表明8位～89位、80位～109位、129位～164位氨基酸區(qū)域至少各存在一個B細胞表位，89位～141位氨基酸區(qū)域內(nèi)至少存在2個B細胞表位，存在2個RNA結(jié)合位點[4]，羧基端238QAYQKRMGVQMQRFK252肽構(gòu)成 CD4+T細胞表位[5]，58位～66位（58GILGFVFTL66）氨基酸構(gòu)成 CD+8細胞毒性 T細胞表位[6]，63位～70位（63FVFTLTVPS70）氨基酸構(gòu)成CD+4 T細胞表位[7]。

本實驗室前期進行了AIV M1、N1和N2基因克隆、表達，獲得具有良好抗原性的表達產(chǎn)物[8-10]；并應(yīng)用噬菌體展示隨機12肽庫，確定了AIV M1蛋白222位～230位氨基酸（222HPNSSARLR230）構(gòu)成一個型特異性表位[11]。在此基礎(chǔ)上，本研究采用針對AIV的M 1蛋白型特異性單克隆抗體（MAb），淘選M 13噬菌體展示的7肽隨機肽庫，獲得與MAb特異性結(jié)合的噬菌體擬位，比對分析噬菌體擬位的共有序列，在病毒M 1蛋白中鑒定相同（似）區(qū)域，結(jié)合不同噬菌體擬位與MAb的免疫反應(yīng)性分析結(jié)果，進一步進行M 1蛋白表（擬）位分析。

1 材料和方法

1.1 MAb、噬菌體展示隨機肽庫及主要試劑 AIV M1 MAb、陰性抗體、M 1重組蛋白由有本實驗室制備[11]。新城疫病毒（NDV）、H5N1、H9N2 AIV抗原購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。包被重組蛋白G的磁性珠、噬菌體展示的7肽隨機肽庫（Ph.D.-7TMPhage Display Peptide Library）購自美國 Beverly New England生物實驗室；辣根過氧化物酶標記的鼠抗M 13抗體（HRP-IgG）購自Amersham-Pharmacia公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；OPD底物購自Sigma公司。

1.2 肽庫庫容量滴定及評價 用TBS將待滴定肽庫作10-1～10-12稀釋，取100μL稀釋液與100μL處于對數(shù)生長期的ER2738E.coli懸液混合，室溫孵育20 min，加至3 ML 42℃的Agarose Top（頂層瓊脂糖營養(yǎng)液），立即涂布LB/Agar/Tet/X-gal/IPTG平板，37℃過夜培養(yǎng)，滴定噬菌體蝕斑形成單位（PFU），計算噬菌體濃度。隨機挑選20個藍色的蝕斑對其攜帶的插入序列進行測序，評價7肽插入序列的隨機性和肽庫的庫容量。

1.3 生物淘選 參照試劑盒說明及參考文獻[9]的方法，將5μLM 1MAb、30μL噬菌體肽庫（約含9×1010PFU）及165μL含有2%脫脂奶粉的TBS（pH7.5）混合，室溫震蕩孵育30min，與蛋白G包被磁性珠混合，室溫震蕩孵育20m in，緩沖液洗滌，用100μL 0.2 mol/L HCl（pH2.2）溶液（含 1 mg/mL BSA）洗脫結(jié)合于磁性珠上的噬菌體，并迅速中和至中性。對每一輪淘選獲得的洗脫液，除少量稀釋后按1.2方法涂布平板，其余用ER2738增殖，純化，進行下一輪淘選。第二輪和第三輪分別使用2μL和1μL M1 MAb，以增強淘選的特異性。經(jīng)3輪“淘選-擴增-淘選”，可以富集與抗體特異性結(jié)合的噬菌體。

1.4 ELISA 在第3輪淘選后涂布的平板上分別隨機挑選48個藍色噬菌體蝕斑，增殖培養(yǎng)后，以MAb及陰性對照鼠源抗體為包被抗體或捕捉抗體，以鼠抗M 13 HRP-IgG為檢測抗體，OPD為底物，進行ELISA檢測。當樣品針對M 1 MAb的OD490nm值與針對陰性抗體的OD490nm值存在2倍或2倍以上差異時，判為陽性。

1.5 外源插入多肽序列分析 根據(jù)野生型噬菌體p III基因（ZY40350）中對所有fd-tet衍生載體均保守的區(qū)域，設(shè)計引物FUSE-U：5'-GCAAGCTGATAAA CCGATAC-3'， FUSE-D： 5'-CCATGTACCGTAACA CTGAG-3'，經(jīng)PCR擴增包含外源插入多肽序列（7肽編碼序列）的基因片段（約330 bp），產(chǎn)物純化后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序。采用DNAMAN Version 5.2.2軟件進行序列比對，分析7肽序列中的共有序列。

1.6 競爭性ELISA 以MAb為包被抗體，天然病毒抗原為競爭劑或阻斷劑，抗M 13 HRP-IgG抗體為檢測抗體，OPD為底物，對噬菌體擬位進行競爭性ELISA分析。檢測OD490nm值。按以下公式計算：抑制率（%）=（OD490nm緩沖液對照-OD490nm試驗）/OD490nm緩沖液對照×100%。設(shè)置陽性、陰性及空白對照。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體展示隨機肽庫的庫容量評價 肽庫噬菌體濃度為8×1011pfu/mL。隨機挑選20個克隆的序列比對分析結(jié)果顯示，20個噬菌體克隆中有兩個無插入序列，其余18個克隆展示的7肽序列各不相同，并且無相同（相似或共有）序列。

2.2 M1 MAb淘選獲得噬菌體克隆的ELISA分析

M 1 MAb第3輪淘選獲得的噬菌體洗脫液，經(jīng)稀釋涂布培養(yǎng)后，隨機挑選96個蝕斑增殖培養(yǎng)，經(jīng)ELISA檢測與MAb發(fā)生特異性結(jié)合的噬菌體克隆，結(jié)果78個噬菌體克隆為陽性（圖1）。

圖1 單克隆抗體淘選后噬菌體克隆ELISA分析Fig.1 ELISA analysis of phage clones after panning by MAb

2.3 陽性噬菌體克隆外源插入序列的PCR擴增挑選20個陽性噬菌體克隆，經(jīng)PCR擴增包含外源插入序列（7肽編碼序列）的基因片段，分別獲得大小約330 bp的擴增產(chǎn)物（圖2）。

圖2 陽性噬菌體克隆插入序列PCR擴增Fig.2 PCR amplification of insert sequence from positive phage clones

2.4 陽性噬菌體克隆展示的7肽序列比對分析PCR產(chǎn)物純化后測序，根據(jù)獲得的核苷酸序列推導7肽氨基酸序列，20個陽性克隆展示的7肽氨基酸序列比對結(jié)果表明，10個克隆含有MDRxL序列（10/20），其中有5個克隆序列完全相同，均為KVMDRWL；有6個克隆序列含有HPR序列（6/20）；2個克隆含有PR序列。1個克隆含有MRxL序列，1個克隆無共有序列序列（表1）。在M 1蛋白氨基酸序列中查找，顯示M 1蛋白93位～95位氨基酸序列為MDR，99位氨基酸序列為L，222位～223位氨基酸序列為HP，230位氨基酸序列為R，分別與獲得MAb識別的共有序列MDRxL或HPR相似。

表1 淘選后噬菌體展示的7肽序列比對分析Table 1 Alignment of peptide sequences displayed by phage after panning

2.5 競爭性ELISA檢測 以M 1 MAb為包被抗體，AIV H5N1、H9N2及NDV抗原為競爭劑或阻斷劑，HRP標記的抗M 13抗體為檢測抗體，OPD為底物，對噬菌體擬位（KVMDRWL或LTHPRFH）進行競爭性ELISA分析，同時設(shè)緩沖液空白對照。結(jié)果表明，在緩沖液空白對照成立的前提下，噬菌體擬位（KVMDRWL或 LTHPRFH）與 M1 MAb間的結(jié)合，能夠被H5N1、H9N2病毒抗原特異性抑制或阻斷（H5N1病毒抗原阻斷效率高于H9N2病毒抗原的阻斷效率），抑制率隨病毒抗原濃度降低而降低，而不能被NDV抗原抑制或阻斷（圖3和圖4）。

圖3 噬菌體擬位（KVMDRWL）競爭性ELISA分析Fig.3 Analysis of phagemimotope（KVMDRWL）by competitive ELSIA

圖4 噬菌體擬位（LTHPRFH）競爭性ELISA分析Fig.4 Analysis of phagem imotope（LTHPRFH）by competitive ELSIA

3 討論

基于病毒與MAb免疫反應(yīng)性差異，篩選或構(gòu)建病毒MAb逃逸株，分析其基因序列差異，以此間接推測抗原表位分布區(qū)域及構(gòu)成表位的關(guān)鍵性氨基酸殘基，對高變異性病毒（如AI），難以獲得表位精確定位結(jié)果[9]。采用分子生物學軟件預測病毒蛋白可能的表位區(qū)域，需要進一步研究確證。采用噬菌體肽庫進行病毒表位分析，可以獲得表位及其關(guān)鍵性氨基酸準確定位結(jié)果[12-13]。

采用針對M 1蛋白的流感病毒型特異性MAb淘選獲得共有序列MDRxL，與M 1蛋白93位～99位（93MDRAVKL99）氨基酸序列結(jié)構(gòu)基本一致。經(jīng)ELISA、競爭性ELISA分析，攜帶MDRxL基序的噬菌體能夠與MAb發(fā)生特異性結(jié)合，并且其結(jié)合能夠被天然病毒抗原特異性抑制或阻斷，表明MDRxL序列及其側(cè)翼序列真實模擬病毒蛋白上與MAb結(jié)合的抗原決定簇或表位的結(jié)構(gòu)和功能，研究提示M 1蛋白93位～99位（93MDRAVKL99）氨基酸區(qū)域構(gòu)成AIV型特異性表位，93位、94位、95位和99位是構(gòu)成表位的關(guān)鍵性氨基酸位點。

淘選獲得第二個共有序列HPR，與本實驗室先前應(yīng)用噬菌體展示隨機12肽庫將AIVM 1蛋白型特異表位定位于222位～230位氨基酸（222HPNSSARLR230）的結(jié)果一致。一般認為一個MAb針對一個病原表位，本研究使用的AIV型特異性MAb能夠與模擬M 1蛋白93位～99位和222位～230位區(qū)域的7肽特異結(jié)合，可能表明本研究使用的MAb需要進一步克隆純化。下一步將應(yīng)用基因分段、截短或連續(xù)缺失表達技術(shù)和合成多肽進行表位精細定位，研究表位抗原性差異的分子基礎(chǔ)。

[1]戚中田.禽流感病毒與人類禽流感[J].中國科學基金，2004，2：68-71.

[2]Helenius A.Unpacking the incom ing influenza virus[J].Cell,1992,69:577-578.

[3]Watanabe K,Handa H,M izumoto K,et al.Mechanism for inhibition of influenza virus RNA polymerase activity by matrix protein[J].JVirol,1996,70:241-247.

[4]Ye Zhi-peng,Baylor N W,Wagner R R.Transcription-inhibition and RNA-binding domains of influenza A virus matrix protein mapped with anti-idiotypic antibodies and synthetic peptides[J].JVirol,1989,63（9）:3586-3594.

[5]Adler S,Reay P,Roy P,et al.Induction of T cell response by bluetongue virus core-like particles expressing a T cell epitope of the M1 protein of influenza A virus[J].Med Microbiol Immunol,1998,187（2）:91-96.

[6]Liu Wan-li,Zou Peng,Cheng Ying-hua.Monoclonal antibodies recognizing EVETPIRN epitope of influenza A virus M2 protein could protect Mice from lethal influenza A virus challenge[J].Immunol Lett,2004,93:131-136.

[7]Plotnicky H,Cyblat-Chanal D,Aubry J P,et al.The immunodominant influenza matrix T cell epitope recognized in human induces influenza protection in HLA-A2/K（b）transgenic Mice[J].Virology,2003,309（2）:320-329.

[8]宋建領(lǐng)，王金萍，等.禽流感病毒M 1蛋白的表達及其免疫反應(yīng)性分析[J].中國病毒學，2005，20（5）：515-518.

[9]宋建領(lǐng)，張富強，等.H9N2亞型禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因的克隆及表達[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38（9）：4-7.

[10]宋建領(lǐng)，張富強，等.待H5N1亞型禽流感病毒神經(jīng)氨酸酶基因的克隆與表達[J].中國病毒學，2006，21（1）：43-46.

[11]宋建領(lǐng)，張文東，等.禽流感病毒M 1蛋白型特異性表位分析[J].中國人獸共患病學報，2008，24（07）：626-630.

[12]張富強，李志華，張念祖.CSFV囊膜蛋白E2單克隆抗體識別表（擬）位基序的差異性分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2005，27（05）：373-379.

[13]Zhang Fu-qiang,Yu M,Weiland E,et al.Characterization of epitopes for neutralizing monoclonal antibodies to Classical sw ine fever virus E2 and Erns using phage-displayed random peptide library[J].Arch Virol,2006,151:37-54.