秦智鋒，劉建利，盧體康，林慶燕，呂建強(qiáng)，曹琛福，阮周曦，曾少靈，陳書(shū)琨，廖立珊，孫 潔，張彩虹，花群義

（1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳 518001；2.深圳市外來(lái)有害生物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518045）

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒屬I型（APMV-1）病毒，該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，能夠在被侵襲的雞群中迅速傳播。NDV被我國(guó)列為一類傳染病，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）須呈報(bào)的疫病，是國(guó)際動(dòng)物產(chǎn)品貿(mào)易中重點(diǎn)檢查的重大動(dòng)物疫病。根據(jù)病毒株致病力的差異，將NDV分為強(qiáng)毒力型、中等毒力型及弱毒力型。NDV中強(qiáng)毒株在雞群中傳播迅速，危害嚴(yán)重[1]；而弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產(chǎn)蛋量下降，多與其他疾病共同發(fā)病而造成一定的危害[2]。因此，建立鑒別NDV并有效區(qū)分中強(qiáng)毒株和弱毒株的新型快速分子生物學(xué)檢測(cè)方法成為迫切要求，對(duì)有效控制疫情、降低經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一種新型的寡核酸衍生物，與TaqMan探針相比，具有兩個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)：一是可增強(qiáng)熱穩(wěn)定性和雜交的特異性，二是LNA探針長(zhǎng)度較短，可增加設(shè)計(jì)的靈活性。

本研究利用LNA探針技術(shù)，針對(duì)中強(qiáng)毒株和弱毒株特異序列分別設(shè)計(jì)了堿基鎖定的LNA探針，極大地提高了探針的Tm值和特異性，并建立了同時(shí)鑒別診斷NDV中強(qiáng)毒株與弱毒株的雙重?zé)晒舛挎i核酸RT-PCR（Duplex LNA rRT-PCR）檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 病毒與血清 NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9、中等毒力I系疫苗（Mukteswar株）購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；NDV標(biāo)準(zhǔn)弱毒株Ⅱ系（B1株）、Ⅲ系（F株）、IV系（Lasota株）和Clone-30弱毒疫苗株均由深圳市獸醫(yī)防疫監(jiān)督所饋贈(zèng)；NDV，禽流感病毒（AIV）H5、H7、H9標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，均購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所；9日齡SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Qiagen Viral RNA Mini Kit購(gòu)自Qiagen公司；美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦的副粘病毒I型（APMV-1）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR（APMV-1-rRT-PCR）檢測(cè)引物探針和NDV中強(qiáng)毒株（vNDV）引物探針[3]由上?；倒竞铣?。

1.3 樣品的采集與檢測(cè) 采集2003年以來(lái)深圳地區(qū)雞場(chǎng)樣品進(jìn)行NDV監(jiān)測(cè)。每個(gè)雞場(chǎng)分大、中、小3個(gè)采樣群采樣。每個(gè)采樣群分別采集喉頭棉拭子和泄殖腔棉拭子30份，每3份合成一個(gè)混合樣，即每個(gè)雞場(chǎng)采集30份混合樣品，于當(dāng)日送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，采用美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦的APMV-1-rRT-PCR進(jìn)行篩選檢測(cè)[3]。

1.4 NDV株的分離與鑒定 對(duì)APMV-1-rRT-PCR篩選陽(yáng)性的樣品，按照《新城疫診斷技術(shù)》（GB/T 16550-2008）進(jìn)行雞胚分離與鑒定。將樣品處理后接種9日齡SPF雞胚，接毒3 d后，無(wú)菌收獲尿囊液進(jìn)行鑒定。

參照OIE手冊(cè)中推薦的標(biāo)準(zhǔn)[4]，采用標(biāo)準(zhǔn)的血凝方法（HA）程序進(jìn)行檢測(cè)。以血凝價(jià)超過(guò)≥23初步判定為具有血凝活性。

將具有血凝性的抗原統(tǒng)一稀釋成4血凝單位的溶液，分別與NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，AIV H5、H7、H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)（HI）。以血凝抑制價(jià)≥23判定為同血清亞型一致的亞型抗原。

1.5 duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法的建立

1.5.1 引物與探針設(shè)計(jì)采用bioEdit（7.0.9.0）軟件，將GenBank中NDV主要代表性強(qiáng)毒力病毒株、中等毒力病毒株和弱毒力病毒株的F基因全序列，以ClusalW方式進(jìn)行排列，選取F基因裂解位點(diǎn)兩端保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，選取裂解位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)鑒別診斷簡(jiǎn)并探針。中強(qiáng)毒株探針和弱毒株探針均使用了簡(jiǎn)并堿基脫氧次黃嘌呤（I）。引物與探針序列見(jiàn)表1，中強(qiáng)毒株探針的5'端用FAM標(biāo)記，弱毒株探針用HEX標(biāo)記，探針的3'端用BHQ基團(tuán)淬滅。

1.5.2 duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法建立參照QIAamp Viral RNA Mini Kit說(shuō)明書(shū)操作，于全自動(dòng)核酸抽提工作站中抽提中強(qiáng)毒株5株（強(qiáng)毒株F48E9、中等毒株I系疫苗、vNDV-YF、vNDV-HB和vNDV-KD）、弱毒株 6株（Ⅱ系、Ⅲ系、IV系、Clone-30、aNDV-YF和aNDV-RR）和陰性對(duì)照尿囊液中病毒核酸。

參照ABI公司AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit操作說(shuō)明書(shū)配制熒光RT-PCR反應(yīng)液。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下：50℃30 Min，95℃10m in；95℃ 10 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，5個(gè)循環(huán)；95℃10 s、60℃40 s，35個(gè)循環(huán)，設(shè)置60℃時(shí)同時(shí)收集FAM和HEX兩種熒光。

1.5.3 Duplex LNA rRT-PCR與Taq Man rRT-PCR檢測(cè)方法靈敏度比較選取強(qiáng)毒株F48E9和弱毒株IV系疫苗尿囊液，10倍系列稀釋成1×10-1～10-10等10個(gè)稀釋度，用EZ1抽提核酸，按照所建立的方法進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。同時(shí)采用美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦的Taq-Man-APMV-1-rRT-PCR檢測(cè)方法和TaqMan-vNDV-rRT-PCR檢測(cè)。測(cè)定duplex LNA rRT-PCR和Taq-Man rRT-PCR檢測(cè)NDV的靈敏度。

表1 NDV中強(qiáng)毒株與弱毒株鑒別引物與探針Table 1 Primers and probes for pathotyping of NDV

1.5.4 Duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)采用duplex LNA rRT-PCR方法，檢測(cè)中強(qiáng)毒株和弱毒株均同時(shí)收集了FAM和HEX兩種熒光，來(lái)檢測(cè)兩個(gè)探針的特異性。

利用duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的雞肉正常組織、雞血清樣品、火雞肌肉組織、鴿組織、豬肉組織、正常雞胚尿囊液、AIV H1N1、H3N2、H5N1、H7Nx、H9N2和傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克病毒等其他家禽病毒和大腸桿菌、沙門氏菌、單增李氏特桿菌等細(xì)菌共22份非NDV陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確定所建立方法的特異性。

1.6 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)2010年～2011年深圳雞場(chǎng)新城疫普查監(jiān)測(cè)的樣品312份混合棉拭子進(jìn)行duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)，同時(shí)按照美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦的標(biāo)準(zhǔn)TaqMan-APMV-1-rRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，按照出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《新城疫中強(qiáng)毒株檢測(cè)方法熒光RT-PCR法》 （SN/T 1686-2005）進(jìn)行TaqMan-vNDV-rRT-PCR檢測(cè)。確定所建立方法的可行性。

2 結(jié)果

2.1 NDV的檢測(cè)與鑒定結(jié)果 自2003年以來(lái)，共采集NDV監(jiān)測(cè)混合棉拭子樣品近6 000份。Taq-Man-APMV-1-rRT-PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的共有121份。對(duì)2004年以前的篩選陽(yáng)性樣品，全部采用雞胚進(jìn)行病毒分離后進(jìn)行HA和HI鑒定。2003年和2004年共鑒定出NDV中強(qiáng)毒株3株，弱毒株2株，由哈爾濱獸醫(yī)研究所進(jìn)行毒力鑒定。詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。最終分離出5株NDV，用于duplex LNA rRTPCR檢測(cè)方法建立以及對(duì)強(qiáng)弱毒株檢測(cè)的特異性分析。對(duì)于2005以后的樣品，采用國(guó)家出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《新城疫中強(qiáng)毒株檢測(cè)方法熒光RT-PCR法》（SN/T 1686-2005）進(jìn)行中強(qiáng)毒株鑒定。

表2 2003年～2004年分離的NDV毒株Table 2 Isolation of NDV during 2003-2004

2.2 Dup lex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法的建立結(jié)果在25μL反應(yīng)體系中，加入分別用FAM標(biāo)記的中強(qiáng)毒株探針和HEX標(biāo)記的弱毒株探針，在設(shè)定的反應(yīng)條件下進(jìn)行duplex LNA rRT-PCR鑒別檢測(cè)。在陰性對(duì)照成立的情況下，F(xiàn)AM標(biāo)記的中強(qiáng)毒株探針特異性地實(shí)時(shí)擴(kuò)增出5株不同中強(qiáng)毒株，HEX標(biāo)記的弱毒株探針特異性地實(shí)時(shí)擴(kuò)增出6株不同弱毒株，兩者之間無(wú)交叉反應(yīng)（圖1）。

圖1 11株NDV株duplex LNA rRT-PCR鑒別檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The differentiation of 11 NDV strainsw ith duplex LNA rRT-PCR

2.2.1 Duplex LNA rRT-PCR與Taq Man rRT-PCR檢測(cè)方法靈敏度比較結(jié)果將10倍系列稀釋的F48E9和IV系疫苗同時(shí)進(jìn)行duplex LNA rRT-PCR單重檢測(cè)靈敏度測(cè)定和TaqMan rRT-PCR靈敏度測(cè)定。測(cè)定結(jié)果顯示，duplex LNA rRT-PCR單重檢測(cè)F48E9的靈敏度為 10-5（圖2），而TaqMan-vNDV-rRT-PCR檢測(cè)F48E9的靈敏度為 10-6（圖3）。通過(guò)計(jì)算，F(xiàn)48E9毒株 10-6稀釋度相當(dāng)于 1個(gè) EID50[3]，而 duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法單重檢測(cè)強(qiáng)毒株F48E9的靈敏度為10個(gè)EID50。Duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)強(qiáng)毒株靈敏度要比TaqMan-vNDV-rRT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度低10倍，而且熒光增幅也有一定的差距。Duplex LNA rRT-PCR單重檢測(cè)LaSota的靈敏度為 10-6（圖4），而TaqMan-APMV-1-rRT-PCR檢測(cè) LaSota的靈敏度為10-7（圖5）。通過(guò)計(jì)算，LaSota毒株10-7稀釋度相當(dāng)于10個(gè)EID50[3]，而duplex LNA rRT-PCR單重檢測(cè)弱毒株 LaSota的靈敏度為 0.1個(gè) EID50。Duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)弱毒株靈敏度要比Taq-Man-APMV-1-rRT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度低10倍，并且熒光增幅也有一定的差距。

圖2 Duplex LNA rRT-PCR單重檢測(cè)F48E9強(qiáng)毒株的靈敏度測(cè)定結(jié)果Fig.2 Sensitivity of duplex LNA rRT-PCR for F48E9 strain detection

2.2.2 Duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果在對(duì)5株強(qiáng)毒株和6株弱毒株建立duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法過(guò)程中，同時(shí)收集了FAM和HEX兩種熒光，顯示兩個(gè)探針的特異性強(qiáng)，相互之間無(wú)交叉反應(yīng)（圖1）。通過(guò)對(duì)22種非NDV陽(yáng)性樣品的檢測(cè)，結(jié)果全部為陰性（圖略），所建立的NDV duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法的特異性為100%（22/22）。表明該方法特異性強(qiáng)，與其他檢測(cè)對(duì)象無(wú)交叉反應(yīng)。而TaqMan-APMV-1-rRT-PCR方法對(duì)11個(gè)NDV株進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，無(wú)法檢測(cè)到clone 30毒株，即使將退火溫度降至45℃，仍然顯示為陰性結(jié)果。

2.2.3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果針對(duì)2010年~2011年312份混合棉拭子樣品進(jìn)行duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)和TaqMan-rRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示兩者的一致性完全相符。共篩選檢測(cè)出NDV中強(qiáng)毒株樣品2份，NDV弱毒株樣品3份。

3 討論

在探針的設(shè)計(jì)過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)采用了簡(jiǎn)并堿基I，既保證了擴(kuò)增時(shí)有一定的優(yōu)選順序，又有效避免了漏檢。堿基I稱作脫氧次黃嘌呤，是一個(gè)自然存在的堿基，雖然不是真正意義上的通用堿基N，但當(dāng)與其它堿基結(jié)合時(shí)，會(huì)比其它錯(cuò)配堿基相對(duì)更穩(wěn)定。脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結(jié)合能力為dI∶dC>d I∶dA>dI∶dG>d I∶dT。鑒于裂解位點(diǎn)探針?biāo)鹊奈恢镁?個(gè)堿基存在，但堿基G的數(shù)量最多，堿基T的數(shù)量最少，為了更好地實(shí)施檢測(cè)，所以選擇了I而非N進(jìn)行探針的設(shè)計(jì)。堿基I在DNA聚合酶的催化下，脫氧次黃嘌呤首選與dC結(jié)合，其次再與A或G結(jié)合，最后與T結(jié)合，既保證了親和性不同，又避免了漏檢現(xiàn)象的發(fā)生。

本研究采用LNA探針的方法，在NDV裂解位點(diǎn)設(shè)計(jì)了針對(duì)中強(qiáng)毒株的LNA探針和針對(duì)弱毒株的LNA探針，使用同一引物來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增，建立了同一反應(yīng)中同時(shí)鑒別檢測(cè)NDV毒力的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。由于采用了雙重?zé)晒鈽?biāo)記探針檢測(cè)，而且探針中采用了簡(jiǎn)并探針的方法，中強(qiáng)毒株探針和弱毒株探針中均具有3個(gè)簡(jiǎn)并堿基，保證了檢測(cè)方法的特異性，避免了假陰性的出現(xiàn)。Kim報(bào)道TaqMan-vNDV-rRT-PCR在檢測(cè)NDV強(qiáng)毒株時(shí)存在有一定的漏檢現(xiàn)象，特別是檢測(cè)Dove/Italy/2736/2000時(shí)出現(xiàn)假陰性[4]。而TaqMan-APMV-1-rRT-PCR在檢測(cè)弱毒株Clone 30時(shí)也出現(xiàn)了漏檢，僅能夠檢測(cè)出部分NDV株，該檢測(cè)方法仍需改進(jìn)或與其它方法聯(lián)合使用。本研究所建立的方法對(duì)所檢測(cè)樣品的特異性達(dá)到100%，檢測(cè)樣品中11個(gè)NDV株全部為陽(yáng)性，并有效區(qū)分其中的中強(qiáng)毒株和弱毒株。在臨床樣品試驗(yàn)中，duplex LNA rRT-PCR共篩查到NDV強(qiáng)毒株2份、弱毒株3份，與Taq-Man-rRT-PCR結(jié)果相一致。驗(yàn)證了本研究所建立方法適合用于實(shí)際樣品中NDV的檢測(cè)。

根據(jù)理論推算，探針中每一個(gè)堿基的錯(cuò)配可導(dǎo)致降低約一個(gè)Ct值，這有可能降低檢測(cè)的靈敏度。本研究所建立的duplex LNA rRT-PCR檢測(cè)方法與TaqMan-rRT-PCR檢測(cè)方法相比，在靈敏度方面大約低10倍，這是本研究方法仍需改進(jìn)的地方。

Wang、Farkas和EW A ldoust等建立了基于Taq-Man-rRT-PCR檢測(cè)方法來(lái)鑒別區(qū)分NDV的中強(qiáng)毒株和弱毒株[5-7]?；诜肿臃椒▽?duì)NDV致病性進(jìn)行分型的報(bào)道還包括地高辛或放射標(biāo)記的雜交探針?lè)?、SYBR Green實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法和熒光水解探針?lè)ǎòㄆ胀ǖ腡aqMan探針?lè)ǎ?。但已?bào)道的NDV檢測(cè)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法在特異性方面都存在問(wèn)題，不能檢測(cè)出全部NDV株，已有檢測(cè)方法仍需改進(jìn)或與其它檢測(cè)方法聯(lián)合使用[7]。而LNA探針技術(shù)通過(guò)化學(xué)修飾來(lái)鎖定核酸，可增強(qiáng)雙鏈體的熱穩(wěn)定性，有效提高目標(biāo)序列雜交的特異性。本研究利用全新的LNA探針?lè)ǎ⒘送瑫r(shí)區(qū)分中強(qiáng)毒株和弱毒株的雙重實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。該方法能夠特異性檢測(cè)NDV并有效區(qū)分中強(qiáng)毒株和弱毒株，適合用于雞場(chǎng)和進(jìn)出境動(dòng)物產(chǎn)品中NDV的快速檢測(cè)。

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