朱 莎 張愛婷 代 臘 顧林英 朱巧明 鄒曉庭*

(1.浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，動物分子營養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058;2.浙江欣欣飼料股份有限公司，嘉興 314005)

鉛是一種常見的灰黑色重金屬元素，鉛及其化合物侵入機(jī)體的主要途徑是消化道和呼吸道，其毒性可損害神經(jīng)系統(tǒng)［1］、生殖系統(tǒng)［2］以及肝臟、腎臟［3］等器官，且鉛易在動物體內(nèi)富集，最終可能通過食物鏈進(jìn)入人體，威脅人類健康。國際癌癥研究署(IARC)將鉛及其化合物劃分為2B族致癌物，其毒性已引起人們的普遍重視。有研究者提出，體內(nèi)不存在任何鉛的安全閾值［4］。國內(nèi)外已有多起鉛中毒的報(bào)道，兒童因鉛中毒導(dǎo)致的智力下降也成為社會廣泛關(guān)注的問題之一。近幾十年來科研工作者在職業(yè)性鉛暴露人群和鼠類等動物模型上對鉛中毒進(jìn)行了大量的研究，目前認(rèn)為鉛誘導(dǎo)自由基的過量產(chǎn)生而導(dǎo)致氧化應(yīng)激是鉛毒性作用的主要機(jī)制之一［5－8］。在畜禽生產(chǎn)中，鉛污染還未受到重視，然而未引起中毒癥狀劑量的鉛可能會降低畜禽的生產(chǎn)性能、免疫能力以及肉蛋品質(zhì)等，而且也最終會通過食物鏈進(jìn)入人體，對人體產(chǎn)生不良影響。

常見的礦物質(zhì)添加劑硫酸錳和硫酸亞鐵等是飼料中鉛的主要來源，還有一部分來自含鉛量高的飼料原料或牧草。我國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 13078—91)規(guī)定豬、雞等配合飼料中鉛的含量不得超過5 mg/kg，但由于原料購入把關(guān)不嚴(yán)以及檢測手段跟不上，采用鉛含量較高的飼料原料或預(yù)混料配制全價(jià)飼料，全價(jià)飼料中的鉛含量就會大大高于國家標(biāo)準(zhǔn)。為此，本試驗(yàn)以蛋雞為研究對象，通過模擬實(shí)際生產(chǎn)中可能存在于飼料中的鉛的含量，人為地在飼糧中添加15、30和60 mg/kg鉛，研究慢性鉛暴露對產(chǎn)蛋高峰期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)以及與抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響，并初步探討其作用機(jī)制，以進(jìn)一步認(rèn)識鉛污染的飼糧對蛋雞的毒害作用，為研究鉛致毒機(jī)理以及后期防治蛋雞鉛中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

試驗(yàn)用硝酸鉛［Pb(NO3)2］購自上海吉滬化工有限公司，分析純，硝酸鉛含量大于99%。

1.2 試驗(yàn)動物與飼糧

試驗(yàn)選用40周齡生產(chǎn)性能相近的海蘭褐蛋雞576羽，采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將試驗(yàn)雞隨機(jī)分為4組:對照組、試驗(yàn)1組(T1組)、試驗(yàn)2組(T2組)、試驗(yàn)3組(T3組)，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)36羽。預(yù)試期1周，正試期8周。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧中鉛的含量為3.57 mg/kg，T1、T2、T3組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加 15、30、60 mg/kg鉛的試驗(yàn)飼糧。

基礎(chǔ)飼糧參照NRC(1994)蛋雞營養(yǎng)需要量配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在浙江省嘉興市桐鄉(xiāng)龍翔蛋雞養(yǎng)殖場進(jìn)行。3層全階梯籠養(yǎng)(每個(gè)籠內(nèi)3只雞)，采用人工光照與自然光照相結(jié)合的方法，每天光照16 h，采用機(jī)械通風(fēng)與自然通風(fēng)相結(jié)合，從而保證雞舍內(nèi)空氣流通良好。蛋雞自由飲水、采食，按常規(guī)免疫程序?qū)ζ溥M(jìn)行接種，定期對雞舍消毒。

1.4 指標(biāo)測定與方法

1.4.1 生產(chǎn)性能測定

試驗(yàn)期間，每天以重復(fù)為單位記錄產(chǎn)蛋數(shù)和總蛋重，每周以重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)總采食量，計(jì)算產(chǎn)蛋率、平均蛋重、平均日采食量及料蛋比。

1.4.2 蛋品質(zhì)測定

在試驗(yàn)中期(第4周末)和試驗(yàn)結(jié)束(第8周末)時(shí)，每組采集雞蛋16枚(各重復(fù)4枚)，用于測定蛋白高度、哈夫單位、蛋黃顏色、蛋殼厚度和蛋殼強(qiáng)度，以上指標(biāo)均采用日本產(chǎn)DET6000蛋品質(zhì)儀測定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air－dry basis) %

1)預(yù)混料為每千克全價(jià)料提供The premix provided the following per kg of the diet:VA 7 000 IU，VD32 500 IU，VE 30 mg，VK31 mg，VB11.5 mg，VB24 mg，VB62 mg，VB120.02 mg，煙酸 niacin 30 mg，葉酸 folic acid 0.55 mg，泛酸pantothenic acid 10 mg，生物素 biotin 0.16 mg，氯化膽堿choline chloride 400 mg，Cu 20 mg，F(xiàn)e 70 mg，Mn 100 mg，Zn 70 mg，I 0.4 mg，Se 0.5 mg。

2)營養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.4.3 血清和肝腎抗氧化指標(biāo)測定

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3只蛋雞，每組12只，禁食24 h后采血，并摘取肝臟和腎臟，制備血清以及肝臟、腎臟組織勻漿，備檢與抗氧化性能相關(guān)的指標(biāo)。

血清、肝臟和腎臟中總抗氧化能力(T－AOC)、總超氧化物歧化酶(T－SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)活性、還原型谷胱甘肽(GSH)含量均由購自南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，試劑的配制和操作步驟均按說明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS(17.0版)進(jìn)行單因子方差分析，均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，各組間的平均值比較采用Duncan氏法多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。以P＜0.05作為差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 鉛對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，在8周的試驗(yàn)期內(nèi)，與對照組相比，各試驗(yàn)組產(chǎn)蛋率和料蛋比均無顯著差異(P＞0.05)。

1～8周各試驗(yàn)組平均蛋重在數(shù)值上均低于對照組，但僅T3組與對照組差異顯著(P＜0.05)，3個(gè)試驗(yàn)組間差異不顯著(P＞0.05)。

除了1～4周T2組外，其余時(shí)間段內(nèi)各試驗(yàn)組的平均日采食量在數(shù)值上均低于對照組，其中5～8周T2組下降程度最大，降低了11.83%(P＜0.05)，1 ～8 周 T1、T2、T3組平均日采食量與對照組相比分別降低了3.72%(P＜0.05)、1.93%(P＞0.05)、3.63%(P＜0.05)，3個(gè)試驗(yàn)組間無顯著差異(P＞0.05)。

表2 飼糧中鉛含量對蛋雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of dietary lead level on performance of laying hens

同行數(shù)據(jù)肩注字母不同表示差異顯著(P＜0.05)，無肩注或肩注有相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same row，values with different letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，while with no or the same letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 鉛對蛋品質(zhì)的影響

由表3可以看出，除了第4周時(shí)T1組蛋黃顏色高于對照組(P＞0.05)以及T3組蛋白高度較對照組降低了23.89%(P＜0.05)外，其余試驗(yàn)組蛋白高度、蛋黃顏色和哈夫單位均隨著飼糧中鉛含量的增加有降低趨勢，但均差異不顯著(P＞0.05)。

飼糧中鉛含量主要對蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度有影響。第4周和第8周時(shí)的蛋殼強(qiáng)度均隨著鉛添加量的增加有降低趨勢，蛋殼強(qiáng)度最小的T3組第4周和第8周時(shí)分別比對照組降低了21.89%、16.84%(P＜0.05)，T2組第4周時(shí)蛋殼強(qiáng)度比對照組降低了15.31%(P＜0.05)，其余試驗(yàn)組與對照組差異不顯著(P＞0.05)。蛋殼厚度的變化趨勢與蛋殼強(qiáng)度類似，與對照組相比，第4周時(shí)T1、T2、T3組分別降低了 9.23%、9.98%、19.20%(P＜0.05)，第8周時(shí)分別降低了4.42%、8.44%、9.50%(P＜0.05)，呈現(xiàn)出明顯的劑量－效應(yīng)關(guān)系。

2.3 鉛對蛋雞血清和肝腎抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可以看出，3個(gè)試驗(yàn)組血清中T－AOC和T－SOD活性均在一定程度上低于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)。對照組血清中GSH－Px活性為 2 848.66 μmol/L，比 T1、T2、T3組分別高出18.03%、27.08%、31.31%(P ＜0.05);T2組GSH含量最低，較對照組和T1組分別降低了41.39%、29.66%(P ＜0.05)。T1、T2、T3組 MDA 含量均在一定程度上高于對照組，其中T3組含量最高，較對照組升高了49.22%(P＜0.05)，3個(gè)試驗(yàn)組間差異不顯著(P＞0.05)。

表3 飼糧中鉛含量對蛋品質(zhì)的影響Table 3 Effects of dietary lead level on egg quality

表4 飼糧中鉛含量對蛋雞血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary lead level on antioxidant indices in serum of laying hens

由表5可以看出，飼料中鉛污染對蛋雞肝臟和腎臟抗氧化性能的影響主要體現(xiàn)在其對T－SOD和GSH－Px活性以及MDA含量有顯著影響上。尤其是最高劑量組T3組，與對照組相比，肝臟、腎臟T－SOD和 GSH－Px活性均顯著降低(P＜0.05)，MDA含量均顯著上升(P＜0.05)。T1、T2組肝臟中GSH－Px活性較對照組分別降低了19.09%、18.70%(P＜0.05)，肝臟其余指標(biāo)無顯著差異(P＞0.05)。與對照組相比，腎臟 T1組 T－SOD、GSH－Px活性均顯著降低(P ＜0.05)，T1、T2組MDA含量均顯著上升(P＜0.05)。T－AOC和GSH含量均在一定程度上低于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 鉛對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

目前的研究還未發(fā)現(xiàn)鉛對生物體有任何的營養(yǎng)生理功能［9］，而眾多研究都證實(shí)了鉛污染對人和動物的生長發(fā)育會產(chǎn)生不良影響［10－12］。余東游［13］在體重33 kg左右豬的飼糧中添加10 mg/kg鉛，豬表現(xiàn)出生長緩慢，采食量與日增重均顯著降低。Shafiqur等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在2～6周齡肉雞的飲水中分別添加250、400 mg/kg醋酸鉛均可顯著降低肉雞的平均采食量和日增重，但對飼料轉(zhuǎn)換率無顯著影響。Jeng等［15］研究表明，在家養(yǎng)蛋鴨飼糧中分別添加10、20 mg/kg鉛對蛋鴨的體重沒有顯著影響，也沒有觀察到與鉛毒性有關(guān)的癥狀，因此認(rèn)為10和20 mg/kg鉛在3個(gè)月的試驗(yàn)期內(nèi)對蛋鴨沒有臨床上的毒性效果，這與Coburn等［16］在野生禽類上的報(bào)道存在一定的差異，可能是家養(yǎng)禽類較野生禽類可忍受更高劑量的鉛。Hermayer等［17］報(bào)道，在蛋雞飼糧中添加 100 mg/kg鉛，56 d的試驗(yàn)期結(jié)束后未發(fā)現(xiàn)鉛對蛋雞生產(chǎn)性能有顯著的影響。但Vodela等［18］研究發(fā)現(xiàn)，飲水含鉛會降低肉雞的日采食量和日增重，削弱免疫功能。本試驗(yàn)中，除了1～4周T2組平均日采食量外，T1、T2、T3組平均蛋重和平均日采食量均在一定程度上低于對照組，且隨著試驗(yàn)時(shí)間的增加，產(chǎn)蛋率、平均蛋重和平均日采食量還有進(jìn)一步降低的趨勢，呈現(xiàn)一定的時(shí)間－效應(yīng)與劑量－效應(yīng)關(guān)系。從以上可以看出，試驗(yàn)結(jié)果不盡相同，可能是因?yàn)殂U暴露的生物種類、暴露劑量、暴露時(shí)間及方式的不同所致。

表5 飼糧中鉛含量對蛋雞肝腎抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of dietary lead level on antioxidant indices in liver and kidney of laying hens

3.2 鉛對蛋品質(zhì)的影響

國內(nèi)外關(guān)于鉛對蛋品質(zhì)影響的研究報(bào)道甚少。蛋品質(zhì)指標(biāo)，如蛋白高度、哈夫單位等是評價(jià)雞蛋品質(zhì)的重要指標(biāo)，蛋白高度越高，哈夫單位越大，說明蛋白越黏稠、品質(zhì)越好。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著飼糧中鉛添加量的增加，雞蛋的蛋白高度、蛋黃顏色和哈夫單位有降低的趨勢，但除了第4周時(shí)T3組蛋白高度較對照組顯著降低外，其余指標(biāo)均與對照組差異不顯著，表明本試驗(yàn)所添加鉛的劑量對雞蛋的蛋白高度、蛋黃顏色和哈夫單位未造成較大影響，可能是由于本試驗(yàn)所用鉛的劑量還未達(dá)到使蛋品質(zhì)這3項(xiàng)指標(biāo)發(fā)生顯著性降低的水平。

蛋殼質(zhì)量包括蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼相對重等多項(xiàng)指標(biāo)。良好的蛋殼質(zhì)量有利于減少雞蛋的破損率、提高種用蛋的孵化率。蛋殼的厚度發(fā)生微小的變化，蛋殼的破損程度便受到很大的影響。據(jù)報(bào)道，蛋殼的厚度在0.38～0.40 mm時(shí)，蛋的破損率一般為2% ～3%，而當(dāng)?shù)皻さ暮穸仍?.30～0.32 mm時(shí)，蛋殼的破損率可高達(dá)10%［19］。一般來說，蛋殼厚度及強(qiáng)度直接影響雞蛋的破損率。Nyholm［20］研究表明，重金屬鉛可以改變蛋殼的結(jié)構(gòu)，干擾蛋殼鈣的沉積和胚胎發(fā)育過程中鈣的流動。蛋殼厚度降低是禽類受污染最重要的標(biāo)志之一。趙立［21］在研究中發(fā)現(xiàn)隨著飼料中鉛沉積時(shí)間的延長，蛋殼厚度逐漸降低，且各組間差異顯著，然而蛋殼強(qiáng)度未發(fā)生顯著變化。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鉛對蛋品質(zhì)的影響主要體現(xiàn)在降低蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度方面，二者均隨著鉛添加量的升高和試驗(yàn)時(shí)間的延長出現(xiàn)了較為明顯的降低，T3組的蛋殼強(qiáng)度顯著低于對照組，T1、T2、T3組的蛋殼厚度均顯著低于對照組。在蛋殼強(qiáng)度方面的變化與趙立［21］的研究結(jié)果不同，原因可能是蛋殼強(qiáng)度不僅由蛋殼厚度決定，蛋的形狀、大小及蛋殼表面的狀況等因素對其也有一定的影響。鉛作為2價(jià)金屬，與鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制相似，因而可通過與鈣競爭直接抑制細(xì)胞對鈣的主動轉(zhuǎn)運(yùn)，有試驗(yàn)報(bào)道鉛中毒會引起體內(nèi)鈣水平降低，認(rèn)為鈣與鉛有一定的拮抗作用［22］。蛋殼厚度及強(qiáng)度與蛋殼中的鈣、磷及維生素D3等含量密切相關(guān)，鈣、磷供應(yīng)不足或比例失調(diào)及維生素D3缺乏均會對蛋殼厚度及強(qiáng)度造成一定的影響。維生素D3的前體是一種激素原，本身無活性，需先在肝臟中代謝成25－羥膽鈣化醇，再在腎臟進(jìn)一步羥基化后才形成有活性的維生素D3。由于肝臟和腎臟是鉛毒性作用的主要靶器官，鉛可能通過對肝腎功能的損傷進(jìn)而間接影響維生素D3的合成，具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

3.3 鉛對蛋雞血清和肝腎抗氧化指標(biāo)的影響

T－AOC是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況的綜合指標(biāo)。它的大小可以反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)［T－SOD、GSH－Px和過氧化氫酶(CAT)等］和非酶系統(tǒng)(GSH、維生素E、半胱氨酸和葡萄糖等)對外來刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，蛋雞血清、肝臟和腎臟中T－AOC隨著飼糧中鉛含量的增加總體呈降低趨勢，但各組間均差異不顯著。

T－SOD和GSH－Px是體內(nèi)清除氧自由基的主要抗氧化酶，前者能歧化超氧陰離子自由基(O－·)生成HO，后者可以使有害的過氧化物

2

22還原為無害的羥基化合物，同時(shí)促進(jìn)H2O2分解。GSH－Px可以與T－SOD協(xié)同構(gòu)成防止活性氧損傷的有效防御體系。這些酶的活性與其清除自由基的能力成正比。本試驗(yàn)結(jié)果表明，血清以及肝腎T－SOD和GSH－Px活性明顯受飼糧中鉛含量的影響，這與金海麗［23］、余東游［13］在豬上的試驗(yàn)，Shyam等［24］在小鼠上的試驗(yàn)結(jié)果一致。鉛對這些抗氧化酶的影響可能基于2個(gè)方面的原因，一方面T－SOD和GSH－Px都是含金屬離子的蛋白酶，而鉛離子(Pb2+)可與這些酶中發(fā)揮活性作用的銅離子(Cu2+)、鋅離子(Zn2+)等2價(jià)金屬離子產(chǎn)生拮抗作用［25］;此外，許多研究也證實(shí)，鉛易與這些抗氧化酶上的巰基(—SH)結(jié)合，破壞酶的空間構(gòu)象［26］，進(jìn)而使酶的活性降低，甚至失活。

GSH是體內(nèi)最主要的、含量最豐富的含巰基的低分子肽，一方面它可以直接清除自由基，另一方面，GSH也是GSH－Px和谷胱甘肽 S－轉(zhuǎn)移酶(GST)2種酶作用的底物，為這2種酶分解過氧化物 所 必 需［27］。 戴 偉［28］研 究 發(fā) 現(xiàn)，飼 喂 含 鉛800 μg/g的飼糧60 d后，羅非魚肝臟和腎臟GSH含量均較對照組顯著降低，Nuran等［29］以及Jeng［30］在小鼠上也得到了類似的結(jié)果。在本試驗(yàn)中，3個(gè)試驗(yàn)組蛋雞血清以及肝腎中GSH含量都較對照組有不同程度的降低，這與前人研究結(jié)果一致。

自由基攻擊不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用而形成脂質(zhì)過氧化物，而MDA就是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其含量可以間接反映脂質(zhì)過氧化損傷程度［31］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)試驗(yàn)組蛋雞血清及肝腎中MDA含量均不同程度地高于對照組，且有一定的劑量－效應(yīng)關(guān)系，T3組血清及肝腎中MDA含量均較對照組顯著上升。可見，鉛可以造成蛋雞體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的過量產(chǎn)生，使機(jī)體受到脂質(zhì)過氧化損傷。Emrah等［32］在大鼠飲水中添加2 000 mg/kg的鉛后發(fā)現(xiàn)其血清中MDA的生成量顯著高于對照組，其他研究人員也有過類似的報(bào)道［33－34］。由上可以得出，鉛使氧化應(yīng)激增強(qiáng)，致使MDA過量產(chǎn)生，進(jìn)而對機(jī)體造成損害。

飼料鉛污染增加了蛋雞血清和肝腎中MDA含量，降低了T－SOD、GSH－Px等抗氧化酶的活性，二者的協(xié)同性證明了飼料鉛污染造成了蛋雞機(jī)體與肝腎組織的氧化損傷。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，飼料中鉛及其含量對蛋雞腎臟抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響高于肝臟，可導(dǎo)致蛋雞較強(qiáng)的腎毒性，究其原因，可能是肝臟的主動調(diào)節(jié)能力和代償能力較強(qiáng)，對鉛毒性有較大的調(diào)節(jié)和適應(yīng)能力。

4 結(jié)論

①飼料鉛污染顯著降低了蛋雞平均日采食量，但對產(chǎn)蛋率和料蛋比無顯著影響。

②飼料鉛污染可以使蛋白高度、哈夫單位有降低的趨勢，降低蛋品質(zhì)，對蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度影響顯著，且隨著時(shí)間的增加，這種降低的效應(yīng)會越來越明顯。

③ 飼料鉛污染可以使抗氧化酶，如SOD、GSH－Px等活性降低，誘發(fā)蛋雞脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量增加。

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