戈婷婷 瞿明仁 張 暉 黎觀紅 鐘志勇 劉光斌

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，南昌 330045)

功能性寡糖也叫非消化性寡糖(NDOS)，是指不被人和動(dòng)物腸道吸收，并能促進(jìn)有益菌的增殖，有益于腸道健康的一類寡糖。功能性寡糖被認(rèn)為是一種具有多種功能的營養(yǎng)生理活性物質(zhì)，由于其難以被動(dòng)物體內(nèi)分泌的消化酶分解，因此在畜牧業(yè)中被看作是一種很有開發(fā)潛力的綠色飼料添加劑。寡糖作為新型的飼料添加劑，是近年來國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。許多報(bào)道已表明功能性寡糖能提高豬、家禽和水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能［1－2］，增強(qiáng)其免疫力［3－4］，降低消化道的發(fā)病率［5－6］。對(duì)于反芻動(dòng)物，功能性寡糖也能降低其胃腸疾病發(fā)生率，改善反芻動(dòng)物瘤胃微生物區(qū)系［7］，提高胃腸道對(duì)食糜的消化率［8］，提高反芻動(dòng)物的免疫功能［9］。但是目前有關(guān)功能性寡糖的研究主要集中在單胃動(dòng)物上，對(duì)反芻動(dòng)物的研究報(bào)道較少，在較少的關(guān)于反芻動(dòng)物的研究又大都集中在對(duì)瘤胃的單個(gè)發(fā)酵參數(shù)，而沒有從瘤胃微生物方面深入研究。本試驗(yàn)以南方的地方品種錦江黃牛為研究對(duì)象，以甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖為研究材料，采用體外批次培養(yǎng)法，探討功能性寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃微生物發(fā)酵的影響，建立瘤胃微生物生長效率模型，為功能性寡糖在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、飼糧及飼養(yǎng)管理

選用3頭體重為(300±15)kg安裝有永久性瘤胃瘺管的健康錦江黃牛，以供瘤胃液的采集。試驗(yàn)動(dòng)物每天飼喂2次(08:00和18:00)，自由飲水?；A(chǔ)飼糧為玉米－麥麩－稻草型，精粗比為20∶80，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)預(yù)飼期14 d，第15天開始采集瘤胃液供體外培養(yǎng)。體外批次培養(yǎng)底物組成與瘤胃液供體牛飼糧組成完全相同。甘露寡糖購自北京奧特奇生物制品有限公司，其有效成分含量大于90%;果寡糖購自河北維爾康制藥有限公司，其有效成分含量大于92%;大豆寡糖購自陜西森弗生物技術(shù)有限公司，純度為98%。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels ofthe basal diet(air－dry basis) %

1)每千克預(yù)混料含 One kilogram of premix contained the following:VA 500 kIU，VD380 kIU，VE 2 000 IU，煙酸nicotinic acid 80 g，Cu 2 g，F(xiàn)e 10 g，Mn 8 g，Zn 6 g，Se 0.02 g，I 0.1g，Co 0.02 g。

2)營養(yǎng)水平值為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用體外批次培養(yǎng)法。體外批次培養(yǎng)裝置參照盧德勛等［10］和程茂基［11］的方法進(jìn)行。該裝置主體為恒溫水浴搖床，其水浴溫度和震蕩速率可調(diào)。培養(yǎng)瓶為瓶口安裝有橡皮塞的150 mL奶瓶，橡皮塞上接有帶三通閥的橡膠管，三通閥可打開和關(guān)閉，三通閥一端與30 mL醫(yī)用玻璃注射器相連，注射器用于測(cè)定體外培養(yǎng)過程中的產(chǎn)氣量。

于晨飼前由3頭錦江黃牛瘤胃內(nèi)上下左右(背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊)不同位點(diǎn)采集足量瘤胃液，灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39℃并通有CO2的滅菌清潔燒杯中，燒杯置于裝有39℃蒸餾水的保溫瓶中，灌滿后立即蓋好保溫瓶蓋子，迅速返回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)4層紗布過濾后持續(xù)通入CO2氣體5 min，然后迅速分裝至已預(yù)熱好并裝有培養(yǎng)底物(基礎(chǔ)飼糧2 g)和人工培養(yǎng)液(20 mL)的培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)瓶加20 mL瘤胃液。接通培養(yǎng)瓶，打開振蕩開關(guān)，開始培養(yǎng)。

根據(jù)培養(yǎng)底物中甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖添加水平的不同，分別設(shè)為4個(gè)組，各組功能性寡糖添加量分別為0(對(duì)照組)、0.80%、1.00%和1.20%，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1.3 樣品的采集與分析

培養(yǎng)24 h后采集樣品，立即用pH計(jì)測(cè)定pH。將培養(yǎng)物用紗布過濾，濾渣無損失地轉(zhuǎn)移入100 mL大坩堝中，置于65℃烘箱中烘干，以測(cè)定可消化有機(jī)物質(zhì)(DOM)的含量。濾液轉(zhuǎn)移至100 mL大離心管中，1 500 r/min離心 15 min，去除原蟲和飼料大顆粒。取10 mL離心上清液用三氯乙酸沉淀法測(cè)定菌體蛋白(BCP)濃度［12］;微生物氮產(chǎn)量(daily microbial nitrogen production，DMNP)的計(jì)算由測(cè)得的BCP濃度除以6.25即得。

微生物生長效率(rumen microbial growth efficiency，MOEFF)=微生物氮產(chǎn)量/

可消化有機(jī)物質(zhì)。

另取10 mL上清液，－20℃保存，以測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，VFA的測(cè)定采用GC－1690氣相色譜儀(杭州科曉化工儀器設(shè)備有限公司)FID檢驗(yàn)器，OV－1701型毛細(xì)管(30 m×0.32 mm×0.5 μm)，2000色譜數(shù)據(jù)工作站，內(nèi)標(biāo)分析法，內(nèi)標(biāo)物為巴豆酸。采用程序升溫，初溫80℃，初時(shí)3.5 min，升速 30 ℃/min，終溫 180 ℃，終時(shí)10 min;進(jìn)樣室溫度260℃，檢測(cè)器溫度260℃;柱前壓力0.05 MPa，氮?dú)庾鳛檩d氣。樣品進(jìn)樣量1 μL。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

基本數(shù)據(jù)處理采用Excel 2003，試驗(yàn)結(jié)果分析采用SPSS 13.0中的One－way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，多重比較用Duncan氏法，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同功能性寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃微生物體外發(fā)酵參數(shù)的影響

2.1.1 不同功能性寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃液pH的影響

在體外培養(yǎng)的整個(gè)過程中，瘤胃液pH均在6.50～7.00之間，符合瘤胃微生物生長的正常范圍。由表2可以看出，雖然飼糧分別添加不同水平的甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃液pH有一定影響，但除了1.00%大豆寡糖組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)外，其余各組與對(duì)照組間差異均不顯著(P＞0.05)，但添加功能性寡糖組的瘤胃液pH均普遍低于對(duì)照組。

2.1.2 不同功能性寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃液BCP濃度的影響

由表2可以看出，添加功能性寡糖的各組BCP濃度均高于對(duì)照組。在甘露寡糖添加組中，1.00%甘露寡糖組培養(yǎng)液中BCP濃度最高，達(dá)1.24 g/L，與對(duì)照組之間差異極顯著(P＜0.01);1.20%甘露寡糖組培養(yǎng)液中BCP濃度也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。在果寡糖添加組中，1.20%果寡糖組培養(yǎng)液中BCP濃度顯著高于對(duì)照組和0.80%果寡糖組(P＜0.05)。在大豆寡糖添加組中，其結(jié)果與甘露寡糖添加組相似，1.00%大豆寡糖組培養(yǎng)液中BCP濃度最高，達(dá)1.26 g/L，與對(duì)照組之間差異極顯著(P＜0.01)，1.20%大豆寡糖組培養(yǎng)液中BCP濃度也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.1.3 不同功能性寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃液VFA濃度的影響

由表2可以看出，在甘露寡糖添加組中，添加甘露寡糖組的培養(yǎng)液中VFA濃度均顯著高于對(duì)照組培養(yǎng)液中VFA濃度(P＜0.05)。在果寡糖添加組中，1.20%果寡糖組的培養(yǎng)液中VFA濃度最高，達(dá)95.97 mmol/L，與對(duì)照組間差異極顯著(P＜0.01);0.80%果寡糖組的培養(yǎng)液中VFA濃度也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);而1.00%果寡糖組的培養(yǎng)液中VFA濃度雖比對(duì)照組高，但差異不顯著(P＞0.05)。在大豆寡糖添加組中，1.00%和1.20%大豆寡糖組的培養(yǎng)液中VFA濃度均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

表2 不同功能性寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effects of different functional oligosaccharides on rumen fermentation parameters of Jinjiang cattle

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)，相同或無字母表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same row，values with different small letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with different capital letter superscripts mean significant difference(P＜0.01)，while with the same or no letter superscripts mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

2.2 不同水平的功能性寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃微生物生長效率的影響

由表3可以看出，甘露寡糖和大豆寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃微生物氮產(chǎn)量和微生物生長效率的影響差異均不顯著(P＞0.05)，但有提高的趨勢(shì);而飼糧中添加果寡糖顯著提高了錦江黃牛瘤胃微生物生長效率(P＜0.05)，并呈現(xiàn)線性關(guān)系。根據(jù)功能性寡糖添加水平與微生物生長效率建立二次曲線模型，當(dāng)甘露寡糖添加水平為1.17%時(shí)，微生物生長效率最大，為59.72 g/kg;當(dāng)大豆寡糖添加水平為1.03%時(shí)，微生物生長效率最大，為59.50 g/kg。

表3 不同功能性寡糖對(duì)錦江黃牛瘤胃微生物氮產(chǎn)量和微生物生長效率的影響Table 3 Effects of different functional oligosaccharides on rumen microbial nitrogenproduction and microbial growth efficiency of Jinjiang cattle

3 討論

國內(nèi)外大量研究表明，功能性寡糖是一種具有多種功能的營養(yǎng)生理活性物質(zhì)，具有促進(jìn)有益菌的增殖的作用。在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加甘露寡糖、果寡糖及大豆寡糖，錦江黃牛瘤胃液pH均在6.5～6.8的正常范圍內(nèi)，這與 Roberfroid［14］和 Santoso 等［15］的報(bào)道一致;適宜的瘤胃液pH是瘤胃微生物正?；顒?dòng)必需的，過酸或過堿都不利于微生物發(fā)酵，甚至可能導(dǎo)致微生物死亡，本試驗(yàn)說明功能性寡糖具有維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定作用。

本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加甘露寡糖、果寡糖及大豆寡糖均提高了錦江黃牛瘤胃液中BCP和VFA的濃度。這可能是由于功能性寡糖促進(jìn)了錦江黃牛瘤胃微生物的生長，使微生物數(shù)量增多，而大量的微生物降解有機(jī)物產(chǎn)生更多的氨態(tài)氮(NH3－N)、VFA 和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)，同時(shí)微生物利用這部分氮源和碳源物質(zhì)合成更多的BCP。王新峰等［16］研究發(fā)現(xiàn)，異麥芽寡糖和果寡糖能改變斷奶羔羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，果寡糖能明顯提高瘤胃總菌、黃化瘤胃球菌及琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量。Fukuya等［17］報(bào)道在仔豬飼糧中添加0.25%的果寡糖，可使仔豬糞便中的雙歧桿菌和乳酸桿菌濃度均升高。Zdunczyk等［18］也報(bào)道甘露寡糖能抑制動(dòng)物腸道中大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的生長。Franklin等［19］報(bào)道，甘露寡糖可以促進(jìn)干奶期母牛腸道有益菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)的生長與繁殖，抑制或減少其致病菌(如沙門氏菌)的生長，從而提高干奶期母牛的特異性免疫反應(yīng)。凌寶明等［20］的體外批次培養(yǎng)試驗(yàn)表明，飼糧添加適量的異麥芽寡糖和果寡糖時(shí)，均可以顯著提高生長綿羊瘤胃液中VFA濃度。劉光斌等［21］的體外培養(yǎng)試驗(yàn)報(bào)道，在綿羊飼糧中添加不同水平的大豆寡糖能增加綿羊瘤胃液總VFA和丙酸濃度，有利于瘤胃發(fā)酵的調(diào)控。Zdunczyk等［18］報(bào)道甘露寡糖能使火雞腸道中丙酸、丁酸等VFA濃度明顯增加。而 Mwenya等［22］的試驗(yàn)結(jié)果卻是，飼糧添加異麥芽寡糖對(duì)綿羊瘤胃丙酸和其他的VFA濃度均不影響。Santoso等［23］研究表明，在奶牛飼糧中添加2%的異麥芽寡糖，可增加丙酸在總VFA中的摩爾比，但差異不顯著。這些研究結(jié)果與本試驗(yàn)相似，說明功能性寡糖具有改善錦江黃牛瘤胃發(fā)酵功能的作用。

關(guān)于添加寡糖對(duì)瘤胃微生物生長效率影響，目前尚未見研究報(bào)道，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加甘露寡糖、果寡糖和大豆寡糖，提高了錦江黃牛瘤胃微生物氮產(chǎn)量和生長效率，其中以果寡糖的作用最為顯著，并呈現(xiàn)線性關(guān)系。添加甘露寡糖和大豆寡糖的瘤胃微生物生長效率隨著添加量的增加而呈增大趨勢(shì)，添加量達(dá)到一定程度后會(huì)逐漸降低，而添加果寡糖隨著添加量的增加而呈線性增大趨勢(shì)，沒有達(dá)到最大值，這可能是由于本試驗(yàn)測(cè)得寡糖添加水平梯度太少而引起的試驗(yàn)誤差。從瘤胃微生物生長效率來看，飼糧添加甘露寡糖和大豆寡糖最大的微生物生長效率所對(duì)應(yīng)的添加水平為1.00%～1.20%。

4 結(jié)論

飼糧添加功能性寡糖能夠穩(wěn)定錦江黃牛瘤胃內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)瘤胃發(fā)酵功能，提高錦江黃牛瘤胃液VFA和BCP濃度，提高錦江黃牛瘤胃微生物氮產(chǎn)量和微生物生長效率。綜合所有的指標(biāo)，得出本試驗(yàn)功能性寡糖的添加水平在1.00%～1.20%之間有利于錦江黃牛瘤胃微生物的生長。

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