黃雅莉 鄒彩霞 黃連瑩 梁賢威 夏中生* 韋升菊 梁 辛

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧 530001)

啤酒糟是一種以大麥為原料，經(jīng)發(fā)酵提取籽實(shí)中部分可溶性碳水化合物生產(chǎn)啤酒后剩下的副產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量高，過瘤胃蛋白質(zhì)含量高，礦物質(zhì)、維生素含量豐富。此外，其適口性好，價(jià)格低廉，貨源較充足，是奶牛的理想飼料。近年來(lái)，隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料資源特別是蛋白質(zhì)飼料日趨緊缺，開發(fā)利用飼料資源，降低飼養(yǎng)成本，已成為世界各國(guó)共同關(guān)心的問題。用富含蛋白質(zhì)的啤酒糟作為奶牛飼糧蛋白質(zhì)源具有以下的優(yōu)點(diǎn):1)節(jié)約飼料;2)可以代替部分精飼料，以減少飼料成本;3)減少熱應(yīng)激。

目前已有許多學(xué)者在啤酒糟飼喂牛方面做了一些研究報(bào)道。王星凌［1］在荷斯坦奶牛飼糧中添加棗、大豆皮和鮮啤酒糟，結(jié)果表明這種低成本的飼糧有助于提高產(chǎn)奶量、乳成分和經(jīng)濟(jì)效益。薛志成［2］利用干啤酒糟代替飼糧中20%的精飼料飼喂泌乳牛，結(jié)果表明飼喂干啤酒糟組產(chǎn)奶量比對(duì)照組減少1.6%，差異不顯著，但是每頭牛每天多盈利0.64元，經(jīng)濟(jì)效益十分顯著。孫桂芬［3］用啤酒糟飼喂泌乳中后期奶牛，結(jié)果表明飼糧中添加啤酒糟不僅可以減緩泌乳中后期奶牛產(chǎn)奶量的下降幅度，而且每頭每天飼喂添加啤酒糟飼糧的奶牛產(chǎn)出凈利潤(rùn)比不添加啤酒糟的奶牛增加0.424元。王海濱［4］報(bào)道啤酒糟飼喂奶牛，當(dāng)精飼料喂量為7.20 kg、鮮啤酒糟喂量達(dá)到10.30 kg時(shí)，奶牛平均泌乳單產(chǎn)最高(14.45 kg)，毛利潤(rùn)為13.68元/(頭·d);當(dāng)精飼料喂量為6.10 kg、鮮啤酒糟喂量達(dá)到11.70 kg時(shí)，毛利潤(rùn)為15.02元/(頭·d)，該研究表明，奶牛飼糧中添加10 kg左右的鮮啤酒糟可提高產(chǎn)奶量，并降低飼養(yǎng)成本，對(duì)泌乳中后期奶牛飼喂效果尤為顯著，對(duì)牛的健康無(wú)不良影響。

啤酒糟在作為蛋白質(zhì)飼料部分替代精飼料飼喂動(dòng)物的研究報(bào)道比較少。因而，更深層次的開展這方面的應(yīng)用研究工作十分重要。本試驗(yàn)利用啤酒糟蛋白質(zhì)含量高的這一特性，通過采用體外產(chǎn)氣的方法，在體外條件下研究飼糧中啤酒糟以不同水平替代豆粕對(duì)水牛瘤胃發(fā)酵功能及甲烷產(chǎn)量的影響，確定啤酒糟替代豆粕的可行性及最佳的替代水平，以緩解我國(guó)日益緊缺的蛋白質(zhì)飼料資源，也為今后開展啤酒糟在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用豆粕、玉米、啤酒糟、玉米秸稈、象草和美國(guó)苜蓿均采自廣西水牛研究所，經(jīng)65℃烘干制成風(fēng)干樣后粉碎過40目篩。經(jīng)過分析測(cè)定，本試驗(yàn)采用的啤酒糟干物質(zhì)含量為25.82%，粗蛋白質(zhì)含量為30.41%，中性洗滌纖維含量為62.60%，酸性洗滌纖維含量為13.55%，粗纖維含量為9.07%，鈣含量為0.31%，磷含量為0.53%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)發(fā)酵底物的精粗比為4∶6(風(fēng)干基礎(chǔ))，其中玉米25%、豆粕15%、玉米秸稈30%、象草30%。啤酒糟以0、25%、50%、75%和100%(風(fēng)干基礎(chǔ))替代發(fā)酵底物中的豆粕。體外產(chǎn)氣試驗(yàn)發(fā)酵底物見表1。另設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)干草美國(guó)苜蓿組，標(biāo)準(zhǔn)干草美國(guó)苜蓿組用于消除試驗(yàn)誤差，在所有時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)所測(cè)的結(jié)果都采用標(biāo)準(zhǔn)干草的測(cè)定值進(jìn)行校正，以消除試驗(yàn)誤差。此外，如果試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)干草的實(shí)測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)值差異很大時(shí)，要重新進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 體外培養(yǎng)體系

本試驗(yàn)采用Mauricio等［5］的壓力讀取式體外產(chǎn)氣系統(tǒng)(reading pressure system)進(jìn)行體外瘤胃發(fā)酵，厭氧人工瘤胃緩沖液的配制參照Theodorou等［6］的方法。體外培養(yǎng)裝置主體為恒溫水浴搖床。培養(yǎng)底物為750 mg(干物質(zhì)基礎(chǔ))，培養(yǎng)時(shí)間為72 h。1.3.2 瘤胃液供體動(dòng)物及其飼養(yǎng)

表1 體外發(fā)酵底物(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Substrates for in vitro fermentation(air－dry basis) %

選擇3頭體重為(400±5)kg安裝有永久性瘤胃瘺管的水牛作為瘤胃液的供體動(dòng)物。飼糧參照廣西水牛研究所的日常飼養(yǎng)配方配制，精粗比為3∶7(風(fēng)干基礎(chǔ))，粗飼料為象草。飼糧營(yíng)養(yǎng)水平為粗蛋白質(zhì)13.72%、產(chǎn)奶凈能6.44 MJ/kg、鈣0.72%、磷0.48%。瘺管牛采用栓系式飼養(yǎng)，每日于08:00和17:00各飼喂1次，自由飲水，常規(guī)光照、驅(qū)蟲及管理。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 產(chǎn)氣量(gas production，GP)的測(cè)定

產(chǎn)氣量測(cè)定參考Theodorou等［6］的方法，分別于培養(yǎng)2、4、6、9、12、24、36、48、72 h 時(shí)用壓力傳感器讀取產(chǎn)氣瓶?jī)?nèi)壓力，并放氣。根據(jù)以下公式計(jì)算出產(chǎn)氣量:

式中:GPt為樣品在t時(shí)刻的產(chǎn)氣量(mL/g)，Pt為樣品在t時(shí)刻讀取的壓力(mPa)，Pt空白為空白對(duì)照在t時(shí)刻的產(chǎn)氣壓力(mPa)，V0為瓶子體積(mL)，101.3為標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(mPa)，W為樣品干物質(zhì)質(zhì)量(mg)。

產(chǎn)氣過程的累積產(chǎn)氣量為各時(shí)間段產(chǎn)氣量之和。

根據(jù)以下公式計(jì)算出各部分產(chǎn)氣量:

GP=a+b(1－e－ct)。

式中:GP為產(chǎn)氣量(mL/g)，a為快速產(chǎn)氣部分產(chǎn)氣量(mL/g)，b為慢速產(chǎn)氣部分的產(chǎn)氣量(mL/g)，c為產(chǎn)氣速率常數(shù)(h－1)，a+b 為潛在產(chǎn)氣量(mL/g)，t為培養(yǎng)時(shí)間(h)。

1.4.2 可消化有機(jī)物含量和代謝能的測(cè)定

以200 mg(干物質(zhì)基礎(chǔ))底物為單位進(jìn)行發(fā)酵，根據(jù)體外產(chǎn)氣法培養(yǎng)24 h后得到的產(chǎn)氣量計(jì)算可消化有機(jī)物，計(jì)算公式如下:

DOM=(7.65 ±0.062)GP24h+(353 ±0.59)［7］。

式中:DOM為可消化有機(jī)物(g/kg)，GP24h為24 h累積產(chǎn)氣量(mL/g)。代謝能計(jì)算公式如下:

DO=17.04+1.108 5GP24h;ME= －0.200 0+0.141 0DO［8］。式中:DO為有機(jī)物消化率(%)，ME為代謝能(MJ/kg)。

1.4.3 氨態(tài)氮濃度的測(cè)定

取體外發(fā)酵培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液5 mL，經(jīng)過3 000 × g 離心10 min，取上清液，采用 Searle［9］、馮宗慈等［10］的改進(jìn)方法，用氯化銨作標(biāo)準(zhǔn)品，采用紫外可見分光光度計(jì)(PE Lambda 35型，美國(guó))在700 nm波長(zhǎng)條件下比色，根據(jù)光密度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線求出氨態(tài)氮的濃度。

1.4.4 微生物蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

取體外發(fā)酵培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液8 mL，采用嘌呤法測(cè)定體外微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量，經(jīng)過處理后的待測(cè)液以0.5 mol/L鹽酸溶液作參比，采用紫外可見分光光度計(jì)(PE Lambda 35型，美國(guó))在260 nm下比色，根據(jù)光密度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線求出RNA測(cè)定值，根據(jù)以下公式計(jì)算微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量:

微生物蛋白質(zhì)(mg/mL)=［RNA測(cè)定值(mg/mL)×RNA含氮量(%)/

細(xì)菌氮中RNA含氮量(%)］×

稀釋倍數(shù) ×6.25［8］。

式中，RNA含氮量為17.83%，細(xì)菌氮中RNA含氮量為10%。

1.4.5 揮發(fā)性脂肪酸濃度的測(cè)定

取體外發(fā)酵培養(yǎng)24 h后的上清液1 mL，加入等體積8.2%的偏磷酸，4℃ 20 000×g下離心10 min，取離心后的上清液加入內(nèi)標(biāo)物巴豆酸，儀器為Agilent 7890A型氣相色譜儀，色譜柱為HPINNOWAX(19091N－133)毛細(xì)管柱，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm。測(cè)定上清液中乙酸、丙酸和丁酸的濃度。

1.4.6 甲烷產(chǎn)量的測(cè)定

分別在培養(yǎng)6、12、24 h時(shí)各抽取10 μL氣體用手動(dòng)式進(jìn)樣法用Agilent 7890A型氣相色譜儀測(cè)定甲烷產(chǎn)量，色譜柱為HP－INNOWAX(19091N－133)毛細(xì)管柱，規(guī)格為30 m ×0.25 mm ×0.25 μm。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Excel軟件進(jìn)行處理，然后用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 72 h內(nèi)產(chǎn)氣量、72 h累積產(chǎn)氣量、可消化有機(jī)物含量和代謝能

由圖1和表2可知，72 h累積產(chǎn)氣量、可消化有機(jī)物含量和代謝能這3個(gè)指標(biāo)隨著啤酒糟替代比例的增加而呈降低趨勢(shì)。72 h累積產(chǎn)氣量0組與25%組、50%組之間差異不顯著(P＞0.05)，這3個(gè)組與75%組差異顯著(P＜0.05)，與100%組差異極顯著(P＜0.01)?？上袡C(jī)物含量和代謝能各個(gè)組之間差異顯著(P＜0.05)。

圖1 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)72 h內(nèi)產(chǎn)氣量的影響Fig.1 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on GP in 72 h

表2 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)72 h累積產(chǎn)氣量、可消化有機(jī)物含量和代謝能的影響Table 2 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on accumulation of GP in 72 h，digestible organic matter content and metabolisable energy

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相鄰小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，相間小寫字母表示差異極顯著(P＜0.01)，相同字母表示差異不顯著(P＞0.05)。下表同。

In the same row，values with adjacent letter superscripts mean significant difference(P＜0.05)，and with alternate letter superscripts mean significant difference(P＜0.01)，while with the same letter superscript mean no significant difference(P＞0.05).The same as below.

由表3可知，快速產(chǎn)氣部分產(chǎn)氣量、慢速產(chǎn)氣部分產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率常數(shù)都隨著啤酒糟替代比例的增加而呈降低趨勢(shì)，變化不顯著(P＞0.05)。

表3 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)各組分產(chǎn)氣量的影響Table 3 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on GP of constituents

2.2 氨態(tài)氮和微生物蛋白質(zhì)濃度

由表4可知，氨態(tài)氮、微生物蛋白質(zhì)濃度隨著啤酒糟替代比例的增加而總體呈降低趨勢(shì)。氨態(tài)氮濃度25%組最高，極顯著高于50%組和75%組(P＜0.01)，這2組之間差異不顯著(P＞0.05)，0組與25%組差異不顯著(P＞0.05)。微生物蛋白質(zhì)濃度0組最高，次之依次為50%組、25%組、100%組和75%組，0組與25%組、50%組差異不顯著(P＞0.05)，與75%組差異極顯著(P＜0.01)，與100%組差異顯著(P＜0.05)。

2.3 揮發(fā)性脂肪酸濃度

由表5可知，乙酸濃度25%組最高，次之依次為50%組、0組、100%組、75%組，25%組顯著高于0組、100%組和75%組(P＜0.05)。丙酸、總揮發(fā)性脂肪酸濃度均以25%組最高，且25%組均顯著高于75%組、100%組(P＜0.05)。丁酸濃度25%組最高，次之依次為75%組、0組、50%組、100%組，25%組顯著高于100%組(P＜0.05)。乙酸/丙酸25%組最高，顯著高于0組和75%組(P＜0.05)。

由表6可知，6 h 75%組甲烷產(chǎn)量最高，顯著高于0組、25%組、50%組(P＜0.05)，這3組之間差異不顯著(P＞0.05)。12和24 h甲烷產(chǎn)量隨著啤酒糟替代比例的增加而呈增加趨勢(shì)。12 h甲烷產(chǎn)量0組與25%組、50%組差異不顯著(P＞0.05)，它們均顯著低于其他2組(P＜0.05)。24 h甲烷產(chǎn)量0組與25%組差異不顯著(P＞0.05)，它們顯著低于50%組(P＜0.05)并極顯著低于75%組、100%組(P＜0.01)。

2.4 甲烷產(chǎn)量

表4 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)氨態(tài)氮、微生物蛋白質(zhì)濃度的影響Table 4 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on concentrations of ammonia nitrogen and microbial protein

表5 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響Table 5 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains atdifferent ratios on concentrations of volatile fatty acids

表6 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響Table 6 Effects of substitution of soybean meal with distiller’s grains at different ratios on methane production mmol

3 討論

3.1 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)產(chǎn)氣量、可消化有機(jī)物含量、代謝能的影響

產(chǎn)氣量作為綜合反映飼料的可發(fā)酵程度指標(biāo)，不僅能表現(xiàn)瘤胃中微生物活動(dòng)的總體趨勢(shì)，還是能反映飼料蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的綜合指標(biāo)［11］。產(chǎn)氣量的多少反映了飼草的可消化性的大小，它與飼料中有機(jī)物的發(fā)酵程度成正相關(guān)，飼料的可發(fā)酵性越強(qiáng)，瘤胃中微生物的活性越高，產(chǎn)氣量就越大，反之則越少。易賢武［12］進(jìn)行了西蘭花莖葉粉不同比例替代豆粕的體外瘤胃發(fā)酵研究，結(jié)果表明隨著西蘭花莖葉粉替代水平的增加，0～72 h累積產(chǎn)氣量逐漸下降。本試驗(yàn)72 h累積產(chǎn)氣量各組之間依次降低，與上述研究結(jié)果相一致?？上袡C(jī)物含量和代謝能是根據(jù)24 h產(chǎn)氣量計(jì)算出來(lái)的，它們與24 h產(chǎn)氣量成正比關(guān)系，所以這2個(gè)指標(biāo)也是隨替代比例增加依次降低。產(chǎn)氣量中慢速產(chǎn)氣部分產(chǎn)氣量、潛在產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣速率常數(shù)0組與50%組相差均不大。

3.2 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)氨態(tài)氮、微生物蛋白質(zhì)濃度的影響

氨態(tài)氮是瘤胃內(nèi)飼料肽、氨基酸、蛋白質(zhì)、尿素、氨化物及其他非蛋白氮分解的終產(chǎn)物，同時(shí)也是瘤胃微生物合成菌體蛋白質(zhì)的主要原料［13］。瘤胃中氨態(tài)氮的濃度過高或過低都不利于微生物的生長(zhǎng)繁殖，因此保持瘤胃液中最適氨態(tài)氮濃度是保證微生物蛋白質(zhì)合成的首要條件。Lees等［14］發(fā)現(xiàn)奶牛補(bǔ)飼蛋白質(zhì)飼料能提高氨態(tài)氮的濃度。夏楠等［15］研究發(fā)現(xiàn)采用豆粕、棉粕、菜籽粕的飼糧山羊瘤胃液氨態(tài)氮濃度顯著高于采用玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)的飼糧，這與前三者的蛋白質(zhì)含量比DDGS高有關(guān)。王夢(mèng)芝等［16］研究羽毛粉、玉米蛋白粉、豆粕和魚粉對(duì)瘤胃微生物體外發(fā)酵的影響，結(jié)果表明氨態(tài)氮濃度豆粕組最高，羽毛粉組最低。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著啤酒糟替代豆粕比例的增加，氨態(tài)氮濃度顯著下降，這與啤酒糟的蛋白質(zhì)含量低于豆粕有關(guān)。本試驗(yàn)與上述研究結(jié)果相一致。

微生物蛋白質(zhì)是反芻動(dòng)物最主要的氮源供應(yīng)者，能提供動(dòng)物蛋白質(zhì)需要的40% ～80%。微生物蛋白質(zhì)濃度反映了微生物利用氨態(tài)氮的能力;微生物蛋白質(zhì)濃度也間接地反映了培養(yǎng)體系中微生物種群的數(shù)量。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，0組微生物蛋白質(zhì)與25%組、50%組差異不顯著，但與75%組差異極顯著、與100%組差異顯著。本試驗(yàn)結(jié)果表明，啤酒糟作為水牛蛋白質(zhì)飼料在0～50%替代豆粕對(duì)體外發(fā)酵特性無(wú)顯著影響。

3.3 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)揮發(fā)性脂肪酸濃度的影響

瘤胃碳水化合物發(fā)酵的主要產(chǎn)物是乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸。它們是反芻動(dòng)物主要的能量來(lái)源及合成乳脂和體脂的原料。揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)量及其比例可顯著影響反芻動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用和生產(chǎn)性能的發(fā)揮。易賢武［12］研究西蘭花莖葉粉不同比例替代豆粕，結(jié)果表明隨著西蘭花莖葉粉替代豆粕的比例增加，總揮發(fā)性脂肪酸濃度下降，但對(duì)乙酸、丙酸和丁酸濃度都無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致。

3.4 啤酒糟替代不同比例豆粕對(duì)甲烷產(chǎn)量的影響

瘤胃內(nèi)甲烷是有機(jī)物發(fā)酵的必然產(chǎn)物之一。瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)生既是能量的損失，同時(shí)也是造成溫室效應(yīng)的主要原因之一。飼糧中粗飼料比例越高，甲烷產(chǎn)量越高［17］。Lovett等［18］認(rèn)為，提高奶牛飼糧精飼料比例能降低甲烷的生成量。本試驗(yàn)在6和12 h 0組甲烷產(chǎn)量與25%組、50%組差異不顯著。12和24 h甲烷產(chǎn)量隨著替代比例的增加而呈增加趨勢(shì)。本試驗(yàn)結(jié)果可以看出啤酒糟作為粗飼料，它替代豆粕的比例越高，產(chǎn)生的甲烷量也越高，飼糧中粗飼料比例越高，甲烷產(chǎn)量越高的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

①啤酒糟0～50%替代豆粕對(duì)體外瘤胃發(fā)酵及甲烷產(chǎn)量無(wú)顯著性影響。

②啤酒糟50%～100%替代豆粕降低了產(chǎn)氣量、可消化有機(jī)物含量、代謝能、微生物蛋白質(zhì)濃度、揮發(fā)性脂肪酸濃度，并顯著提高甲烷產(chǎn)量。

③啤酒糟作為水牛蛋白質(zhì)飼料0～50%替代豆粕為宜。

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