劉春明，王強，楊帆，胡楊

（長春師范學(xué)院中心實驗室，吉林長春 130032）

車前草是車前科車前屬（Plantago）車前Plantago asiaticalL的干燥全草[1]。車前草多酚從車前草中提取的天然植物多酚類活性化合物，這類化合物含有酚羥基基團，具有抗氧化、清除體內(nèi)自由基的能力、延緩衰老的能力，是一類極具開發(fā)價值的天然產(chǎn)物[2-4]。因此，尋找一種高效、實用的提取、純化工藝是進一步開發(fā)車前草多酚的主要環(huán)節(jié)。

大孔樹脂是一種有機高分子聚合物，具有比表面積大、吸附容量大、選擇性好、再生處理方便等諸多優(yōu)點[5]，近年來，在植物中多酚化合物的純化應(yīng)用越來越多，如茶多酚[6]、蘋果多酚[7]、葡萄多酚[8]等。本文采用大孔樹脂對車前草多酚進行了分離純化。以期建立大孔樹脂分離純化車前草多酚的分離純化工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

車前草采于吉林市左家，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)鄧名魯教授鑒定為車前科植物車前Plantago asiatica L.車前科植物車前的干燥全草。

1.2 儀器與試劑

DU800紫外可見分光光度計：美國BECKMAN COULTER公司；ALPHA2-4 LSC真空冷凍干燥機：德國CHRIST公司；3K30臺式冷凍離心機、沒食子酸：德國Sigma公司；大孔樹脂：天津南開大學(xué)化工廠；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 車前草多酚提取液的制備

準確稱取車前草粗粉500 g，加入70%乙醇回流提取3次，每次4 000 mL，每次1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇，殘渣加水溶解至1 000 mL（0.5 g藥材/mL），離心，備用。

1.2.2 車前草多酚含量測定方法

1.2.2.1 酒石酸亞鐵溶液的配制

準確稱取FeSO4·7H2O 1 g，酒石酸鉀鈉5 g，加蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至容量瓶，用蒸餾水定容至1 000 mL，避光保存。

1.2.2.2 pH為7.5的磷酸緩沖液的配制

準確稱取 Na2HPO4·12H2O 60.2 g，NaH2PO4·2H2O 5 g，加蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至容量瓶，加蒸餾水定容至1000 mL，冷藏。

1.2.2.3 標準曲線的制備

精密稱取沒食子酸標準品500 mg，用蒸餾水溶解定容至50 mL。吸取5 mL，用蒸餾水稀釋至10 mL容量瓶，得到5 mg/mL的標準溶液，分別吸取 80、120、160、200、240、280 μL 標準溶液置于 25 mL 容量瓶中，加蒸餾水4 mL，酒石酸鐵溶液5 mL，搖勻，再加入pH為7.5的磷酸緩沖溶液稀釋至刻度，用蒸餾水代替標準品溶液加入同樣試劑作空白，于540 nm波長測定吸光度值。以濃度c為橫坐標，吸光度值A(chǔ)為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程為濃度c和吸光度值A(chǔ)的關(guān)系：A=15.335c-0.054 9，r=0.999 8，在 0.016 mg/mL～0.056 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2.4 樣品含量的測定

從樣品溶液中量取1 mL，按照標準曲線項下方法于540 nm處測定吸光度，從標準曲線上讀出濃度值即可。

1.2.3 樹脂的預(yù)處理

取大孔樹脂加乙醇浸泡至充分溶脹，用乙醇洗滌至加蒸餾水無渾濁，再用蒸餾水洗滌至無醇味，備用。

1.2.4 靜態(tài)吸附實驗

量取濕樹脂10 mL置于250 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL車前草多酚提取液，置于振蕩器中，25℃，120 r/min振蕩2 h，放置過夜，充分吸附后，從上清液中取樣，測定多酚含量。根據(jù)公式計算樹脂靜態(tài)吸附量：

吸附量（mg/mL）=（C0-C）V/G

式中：C0、C 為吸附前后車前多酚的含量，（mg/mL）；V為供試液體積，mL；G為樹脂量取量，mL。

1.2.5 靜態(tài)解吸實驗

將10 mL充分吸附的樹脂過濾，用水沖洗后濾干，置于具塞錐形瓶中，加入95%的乙醇水溶液50 mL，密封置于振蕩器中，25℃，120 r/min振蕩，解吸一定時間后，從上清液中取樣，測定多酚含量。根據(jù)公式計算靜態(tài)解吸率：

解析率（%）=C×V×100/W

式中：C為洗脫液多酚濃度，（mg/mL）；V為洗脫液總體積，mL；W為吸附總量，mg。結(jié)果表明靜態(tài)解吸率為71.60%。

1.2.6 動態(tài)吸附實驗

樹脂濕法裝柱（內(nèi)徑1.2×30 cm），柱高11.5 cm，以1 mL/min的流速加入車前多酚含量為3.972 mg/mL的供試液20 mL，吸附飽和后，樹脂柱用蒸餾水洗滌至用苯酚硫酸法檢測至無糖，以去除樹脂吸附的糖和水溶性雜質(zhì)，然后用洗脫液洗至無色為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)試驗

2.1.1 樹脂種類的選擇

選用 AB-8、DA201、D101、DM301 4 種大孔樹脂對車前草多酚進行靜態(tài)吸附試驗，結(jié)果見圖1。

圖1 樹脂對車前草多酚的靜態(tài)吸附量Fig.1 Amount of static adsorption of different types of resin for Plantago asiatic

由圖1可知，吸附達到平衡后，4種樹脂均可吸附多酚物質(zhì)，說明大孔樹脂對多酚物質(zhì)的吸收具有選擇性，其中弱極性樹脂D101和AB-8對多酚的吸附能力較強，中極性樹脂DM301和極性樹脂DA201吸附能力較弱，為進一步選定樹脂種類，對AB-8和D101進行靜態(tài)解吸試驗，結(jié)果見圖2。

圖2 樹脂對車前草多酚的靜態(tài)解吸曲線Fig.2 Static desorption curves of different types ofresin for Plantago Asiatic polyphenols

由圖2可知，D101樹脂在2 h內(nèi)基本達到解吸平衡，解吸率為81.6%；AB-8樹脂在2.5 h內(nèi)基本達到解吸平衡，解吸率為79.8%，多酚類物質(zhì)基本被洗脫下來。因此選用D101型樹脂對車前多酚提取物進行純化。

2.1.2 靜態(tài)吸附時間的確定

圖3為D101樹脂靜態(tài)吸附曲線。

圖3 D101樹脂靜態(tài)吸附曲線Fig.3 Static adsorption curves of D101 resin

從吸附曲線上得知，吸附2 h后，車前草多酚濃度不再減少，大孔樹脂達到吸附達到平衡。因此，吸附時間選擇在2 h。

2.2 動態(tài)試驗

2.2.1 上樣速度的考察

樹脂濕法裝柱，粗提液以不同的流速上樣，使樣品動態(tài)吸附，計算吸附量。圖4顯示了不同的上樣速度對吸附率的影響。

圖4 供試液車前多酚上樣速度對吸附效果的影響Fig.4 The influence of the content of the Plantago Asiatic polyphenols on the adsorption

上樣速度慢，有利于樹脂對多酚類化合物的吸附，流速過快，溶液中的多酚物質(zhì)會來不及吸附到樹脂的內(nèi)表面，就被沖出柱子，導(dǎo)致吸附量降低。但流速低會影響到生產(chǎn)效率，延長生產(chǎn)周期。由圖4可知，在2 BV/h、3 BV/h兩種上樣速度，樹脂吸附性能相差不大，優(yōu)于4 BV/h的情況。因此，上樣速度選擇3 BV/h。

2.2.2 洗脫劑濃度的考察

樹脂濕法裝柱，將車前草粗提液裝入樹脂柱中，進行吸附，再用蒸餾水洗滌至流出液無色。然后分別用10%、30%、50%、70%、90%乙醇進行洗脫，分別測定洗脫液中多酚含量，繪制洗脫曲線見圖5。

圖5 乙醇濃度對解吸效果的影響Fig.5 Effect of EtOH concentration on desorption rate

選擇曲線最高點作為洗脫濃度，由洗脫曲線可知，選擇30%乙醇作為車前草多酚的洗脫溶劑。

2.2.3 洗脫流速的考察

樹脂濕法裝柱，車前草粗提液以3 BV/h速度上樣，吸附2 h后，先用蒸餾水洗脫至無色，再分別用乙醇溶液以不同速度洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總多酚的量，計算洗脫效率，結(jié)果見圖6。

圖6 洗脫速度對解吸率的影響Fig.6 The influence of elution speed on the adsorption rate of Plantago Asiatic polyphenols

從圖6可以看出，洗脫速度為2 BV/h與4 BV/h時洗脫率較好，洗脫率相差不大，考慮到實際生產(chǎn)，洗脫速度慢，時間長，因此選擇4 BV/h進行洗脫。

3 結(jié)論

在D101大孔樹脂對車前草多酚的分離純化中，當供試液的車前草多酚含量為3.972 mg/mL，以30%乙醇作為洗脫劑，進樣速度為3 BV/h，吸附時間為2 h，洗脫速度為4 BV/h時，車前草多酚純度由原來的3.07%提高到17.36%，純度提高了近5倍。說明D101大孔樹脂發(fā)純化車前草多酚雖然能使其純度得到了一定的提高，但還不夠理想，若想得到純度更高的的車前草多酚還要結(jié)合其他的分離純化方法。

車前草作為藥食同源的中藥材，近幾年，其綜合利用價值逐漸引起人們的重視，除作藥用外，在保健食品中也得到廣泛的應(yīng)用，目前已開發(fā)出了一些新產(chǎn)品，如車前草可溶性膳食纖維、保健飲料等。而對車前草中具有抗氧化、抗衰老作用的多酚類成分的研究還不夠深入[6-7]。本研究對車前草多酚的開發(fā)研究具有重要意義。

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