大孔樹脂純化薰衣草總黃酮的工藝

趙軍，譚為，徐芳，陳燕，顧政一，馬龍

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊 830004）

熏衣草Lavandula augustifolia為唇形科熏衣草屬芳香植物狹葉薰衣草的全草，廣泛栽培種植于世界各地，具有消散寒氣、補(bǔ)胃理腦、燥濕止痛之功效，用于治療胸腹脹滿、感冒咳喘、頭暈頭痛、心悸氣短、關(guān)節(jié)骨痛等病癥的治療，被收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：維吾爾藥分冊(cè)》中[1-2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究結(jié)果顯示，黃酮類化合物是薰衣草除精油外發(fā)揮藥效的主要標(biāo)識(shí)性化學(xué)成分，該類成分的研究已成為近年來薰衣草研究的熱點(diǎn)[3-5]。大孔吸附樹脂是一種具有吸附容量大、工藝流程短、易放大、再生容易等特點(diǎn)的分離材料，已被廣泛用于中藥有效成分的分離富集以及創(chuàng)新中藥的研發(fā)之中[6]。本論文通過優(yōu)選大孔吸附樹脂富集薰衣草總黃酮的工藝參數(shù)，建立適合工業(yè)化生產(chǎn)的純化工藝，為其進(jìn)一步的新藥開發(fā)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薰衣草藥材購自新疆烏魯木齊市維吾爾醫(yī)院；蘆丁對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200707；大孔吸附樹脂 AB-8、D101、HPD100、HPD400、HPD450、HPD500 和 HPD750 購自滄州寶恩化工有限公司（使用前按產(chǎn)品說明進(jìn)行預(yù)處理）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

島津UV-2501PC紫外可見分光光度計(jì)：日本島津有限公司；梅特勒AL204型電子天平：梅特勒-托利多上海有限公司；RE-5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取蘆丁對(duì)照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 和6.0 mL，置于25 mL量瓶中，各加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外－可見分光光度法（附錄ⅤA），在509 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.525 1x－0.022 3（r=0.999 6），在 0.2 mg～1.2 mg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2 上柱液的制備及總黃酮的含量測定

稱取薰衣草藥材粉末（過20目篩），加10倍量水，煎煮3次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮至一定量，即得。其總黃酮含量測定以標(biāo)準(zhǔn)繪制的方法的測定，按回歸方程計(jì)算所含總黃酮的含量。

1.3.3 大孔吸附樹脂型號(hào)的篩選

1.3.3.1 靜態(tài)吸附行為的考察

稱取不同型號(hào)大孔樹脂各5.0 g，分別置250 mL三角瓶中，加樣品溶液200 mL，每隔5 min振搖10 s，持續(xù)2 h，然后靜置24 h，充分吸附后，濾過，測定吸附前后溶液中薰衣草總黃酮的含量，計(jì)算飽和吸附量：飽和吸附量=（原料液質(zhì)量濃度×原料液體積－流出液質(zhì)量濃度×流出液體積）/濕樹脂的量。進(jìn)一步，將吸附后的樹脂裝入層析柱中，先以水洗脫除雜，再以120 mL 70%乙醇溶液解吸，測定解吸液中薰衣草總黃酮含量，計(jì)算解吸率（%）。

1.3.3.2 動(dòng)態(tài)吸附行為的考察

精密稱取已處理好的7種樹脂各10 g，裝入直徑2.0 cm的層析柱中，各加入75 mL樣品液（3.17 mg總黃酮/mL）上樣，用上樣流出液在反復(fù)上樣5次后，先以去離子水洗脫5 BV，再以70%乙醇溶液150 mL洗脫，上樣洗脫流速均為1.0 mL/min，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，計(jì)算精制后薰衣草總黃酮的純度和得率。

1.3.4 吸附與解吸工藝研究

通過上述實(shí)驗(yàn)，選擇出一種較優(yōu)的樹脂，對(duì)最大上樣量、上樣流速、上樣液的pH、洗脫劑乙醇濃度和流速以及洗脫除雜用水量進(jìn)行考察，將預(yù)處理好的樹脂濕法裝入層析柱中，將薰衣草總黃酮提取液上柱，待樣品溶液全部通過樹脂柱后，用去離子水洗至流出液無色，再以不同濃度的乙醇以一定洗脫速度洗脫，收集洗脫液。通過測定總黃酮含量考察各因素對(duì)樹脂吸附性能的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂型號(hào)的篩選

大孔吸附樹脂型號(hào)的篩選結(jié)果見表1、2。

表1不同樹脂對(duì)薰衣草總黃酮靜態(tài)吸附結(jié)果Table 1 Performance of adsorption and desorption for total flavonoids with various resins

表2 不同型號(hào)大孔樹脂純化得薰衣草總黃酮的純度與得率Table 2 Purity and yield rate of total flavonoids though various resins

由表1、表2可知，7種樹脂的靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)以AB－8的吸附量和解吸率均最高，每克樹脂可以吸附9.563 mg薰衣草總黃酮，解吸率達(dá)到了78.17%；動(dòng)態(tài)吸附以AB－8樹脂獲得薰衣草總黃酮的純度和解吸率均最高，分別達(dá)到了62.35%和84.70%。因此，選定AB－8樹脂作為薰衣草總黃酮富集純化的最佳樹脂型號(hào)。

2.2 AB－8大孔吸附樹脂對(duì)薰衣草總黃酮的吸附與解吸工藝研究

2.2.1 最大上樣質(zhì)量的考察

將薰衣草總黃酮溶液（3.19 mg總黃酮/mL）150 mL緩慢加入裝有10 g AB－8樹脂的層析柱中，流速為1.0 mL/min，每樹脂床體積（BV，15 mL）收集 1個(gè)流分，測定流出液中總黃酮的含量，以考察樹脂的最大吸附量，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，從第5個(gè)BV開始，總黃酮出現(xiàn)少量泄漏；10個(gè)BV時(shí)，AB-8樹脂對(duì)總黃酮的吸附量達(dá)到飽和，即15 mL AB-8樹脂達(dá)到飽和吸附時(shí)可吸附478.5 mg黃酮。為了避免造成總黃酮的泄漏，擬定最大上樣量為12.76 mg/mL。

2.2.2 pH對(duì)吸附量的影響

以0.1%HCl及0.1%NaOH將上樣液的pH調(diào)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0，在相同條件下以1.0 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，計(jì)算在不同pH下的動(dòng)態(tài)吸附量，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在堿性條件下，薰衣草總黃酮可與堿形成鹽，幾乎不被吸附，pH=8時(shí)的吸附量僅為0.49 mg/mL。pH過小，可與酸形成垟鹽，也不利于吸附。在弱酸條件下黃酮以分子形式存在，吸附量最大，在pH=6.0時(shí)達(dá)到11.18 mg/mL。因此選定上樣液的pH為6.0左右，由于其本身pH為5.9，故可直接上樣。

2.2.3 上樣速度對(duì)吸附量的影響

將上樣溶液100 mL通過裝有10 g AB-8大孔樹脂的吸附柱里，分別以 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min 的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，測定吸附后總黃酮的濃度，計(jì)算薰衣草總黃酮的飽和吸附量，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，樹脂的吸附容量隨流速的增大下降。原因可能要考慮到樹脂的內(nèi)擴(kuò)散效應(yīng)，當(dāng)流速過快，則溶液通過樹脂床的速度大于傳質(zhì)速度，總黃酮分子來不及擴(kuò)散到樹脂的內(nèi)孔就已經(jīng)流出，從使得樹脂的吸附容量減少。因此，在相同條件下，上樣流速慢有利于薰衣草黃酮的吸附，即當(dāng)吸附流速為1.0 mL/min時(shí)吸附果最好，因此選擇1.0 mL/min的流速進(jìn)行上柱。

2.2.4 洗脫劑的選擇

精密稱取4份AB-8樹脂，每份10 g，濕法裝柱，分別精密吸取薰衣草提取物溶液75 mL溶解后分別上柱，以蒸餾水洗至無色，再分別用30%、50%、70%和95%乙醇溶液150 mL洗脫，分別收集洗脫液濃縮至干。計(jì)算總黃酮的純度和解吸率，總黃酮解吸率=（洗脫液總黃酮量/上柱總黃酮量）×100%，結(jié)果見表3。

表3 乙醇濃度對(duì)AB-8樹脂分離純化薰衣草總黃酮的影響Table 3 Effects of ethanol concentrations on the desorption of total flavonoids %

由表3可知，以70%乙醇洗脫解吸率最高，總黃酮純度接近于50%乙醇洗脫物；以95%乙醇洗脫雖然有較高的解吸率，但其總黃酮純度很低。綜合考慮，選擇70%乙醇溶液作為薰衣草總黃酮的洗脫劑。

2.2.5 洗脫劑用量的考察

取已吸附好薰衣草總黃酮的AB-8樹脂10 g，用蒸餾水洗脫8 BV后，再用70%乙醇溶液洗脫每樹脂床體積（15 mL）為一個(gè)流分，至洗脫液近無色，分別測定各流分中的總黃酮含量，結(jié)果如圖4所示，可知，以70%乙醇溶液洗脫，在洗脫2倍柱體積時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高，隨后其含量逐漸降低，5倍柱體積洗脫液便可將絕大部分黃酮洗脫下來，到6倍柱體積含量已經(jīng)很低，故確定洗脫劑用量為5 BV。

2.2.6 洗脫除雜用水量考察

稱取AB-8型干樹脂10.0 g，置直徑為2.0 cm的洗脫柱中，加入100 mL樣品溶液充分吸附后，去離子水以1.0 mL/min的速度洗脫，每15 mL收集一流份，至洗脫液Molish反應(yīng)呈陰性，且水洗脫各流份分別濃縮干燥至恒重，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著用水量的增加，所得浸膏量（雜質(zhì)）在不斷減少，到6倍柱體積時(shí)，大部分雜質(zhì)被洗脫下來。綜合成本考慮，薰衣草水提取物樣品上大孔樹脂后，以5倍量去離子水除雜。

3 結(jié)論

從7種大孔吸附樹脂中篩選出來的AB-8樹脂對(duì)薰衣草總黃酮具有較高的吸附量（靜態(tài)吸附量達(dá)9.563 mg/g樹脂），且易于解吸（解吸率為78.17%），動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)也說明了這一點(diǎn)。動(dòng)態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)顯示薰衣草總黃酮的最大上樣量為12.76 mg/mL樹脂，吸附流速為1.0 mL/min，70%乙醇較好的解吸能力，解吸率達(dá)85.58%，所得總黃酮的含量可達(dá)60%以上。該工藝簡單易操作、成本低、無污染，適用于薰衣草總黃酮的工業(yè)化大生產(chǎn)。

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[1]劉勇民.維吾爾藥志上冊(cè)[M].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社,1999:394-396

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)[S].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社,1998:112

[3]Torras-Claveria L,Jauregui O,Bastida J,et al.Antioxidant activity and phenolic composition of Lavandin(Lavandula intermedia EmericexLoiseleur)waste[J].JAgricFoodChem,2007,55(21):8436-8443

[4]吳霞,劉凈,于志斌,等.薰衣草中黃酮類化學(xué)成分的研究[J].中國中藥雜志,2007,32(9):821-823

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