陳亞，高鹽生

（江蘇省鹽城技師學(xué)院，江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鹽城 224002）

硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，簡(jiǎn)稱 CS）是存在于動(dòng)物軟骨組織中的多種酸性多糖的混合物，主要通過共價(jià)鍵與核心蛋白質(zhì)相連，以蛋白聚糖的形式存在[1-2]。CS具有降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性，在醫(yī)藥、保健食品、美容化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3]。作為我國重要的天然生化藥物資源，CS除了滿足國內(nèi)市場(chǎng)需要外，還是我國生化藥物的第三大出口產(chǎn)品，僅次于氨基酸和肝素鈉，年出口總量達(dá)3 700 t。隨著各國對(duì)CS產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高，國際上對(duì)高純度CS的需求趨于旺盛，市場(chǎng)前景看好[4]。

目前，CS主要是從動(dòng)物的軟骨組織中提取獲得，提取方法有堿法、堿鹽法、酶法、超聲波法和乙酸抽提法等，國內(nèi)較多采用堿提—酶解—醇沉的方法制備CS[5]，該工藝中酶解的主要目的是利用蛋白酶水解蛋白質(zhì)的特異性，使軟骨中的膠原蛋白和黏性蛋白等蛋白質(zhì)水解成多肽或氨基酸，再根據(jù)氨基酸與CS在某些溶劑中的溶解性差異，實(shí)現(xiàn)CS與其它雜質(zhì)的分離，從而提高CS的純度，因此酶解是CS提取中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，酶解效果直接關(guān)系到CS的得率和品質(zhì)[6]。通常情況下，酶解工藝所用酶多為專一性較低的蛋白酶，比如胰酶[5，7]、木瓜蛋白酶[8]、堿性蛋白酶[9]等，但由于酶作用的特異性，導(dǎo)致其對(duì)蛋白質(zhì)的水解不充分，產(chǎn)品純度不高。因而有學(xué)者采用由多種酶組成的復(fù)合酶對(duì)原料進(jìn)行酶解以提高CS的提取效果[2，10]，但由于不同酶的最佳作用條件的差異，酶解工藝條件較難把握。本研究以豬喉軟骨為原料，通過堿提-酶解-醇沉的方法制備CS，并采用二次酶解法對(duì)酶解這一直接影響CS品質(zhì)的關(guān)鍵步驟開展優(yōu)化研究，為工業(yè)生產(chǎn)提供有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬喉軟骨：市售。

胰酶和中性蛋白酶：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；鹽酸氨基葡萄糖：南通雙林生物制品公司；其他試劑，國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1604型電子天平：上海上天精密儀器有限公司；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；722型可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水多用真空泵：鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；KYC-100C空氣恒溫?fù)u床：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 提取工藝與方法

1.3.1 工藝流程

采用改進(jìn)的堿提—酶解—醇沉的工藝流程：原料預(yù)處理→堿液提取→酶解Ⅰ（胰酶）→酶解Ⅱ（中性蛋白酶）→沉淀干燥→CS產(chǎn)品。與傳統(tǒng)工藝相比，本研究采用二次酶解的方法，即經(jīng)胰酶水解后的產(chǎn)物再利用中性蛋白酶進(jìn)一步酶解。

上述工藝中的原料預(yù)處理、去除雜質(zhì)、沉淀干燥等實(shí)驗(yàn)方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[2，5]；堿液提取、酶解Ⅰ的工藝經(jīng)前期的優(yōu)化研究，堿液提取的最佳工藝為堿液濃度 10.0%、料液比 1∶1.6（g/mL）、提取時(shí)間 3.9 h、提取溫度40.0℃，胰酶酶解的最佳工藝為胰酶濃度1.0%、pH8.6、酶解溫度46℃、酶解時(shí)間2.8 h（詳細(xì)結(jié)果將另文報(bào)道）；本文重點(diǎn)對(duì)酶解Ⅱ環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化研究。

1.3.2 中性蛋白酶酶解的工藝優(yōu)化

胰酶酶解產(chǎn)物用2 mol/L的HCl調(diào)pH至7.0左右，加入中性蛋白酶進(jìn)行二次酶解。根據(jù)影響酶促反應(yīng)的因素，以CS純度和產(chǎn)率為分析指標(biāo)，分別對(duì)酶解過程中的酶濃度、pH、酶解溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行單因素影響的實(shí)驗(yàn)，篩選單因素的最佳條件。

1.3.3 產(chǎn)品檢測(cè)

CS產(chǎn)率計(jì)算：CS產(chǎn)率=提取的CS質(zhì)量/供試豬軟骨質(zhì)量×100%；

CS純度檢測(cè)，根據(jù)《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》，以氨基葡萄糖含量為CS純度指標(biāo)，采用Elson-Morgan法測(cè)定氨基葡萄糖含量[11]——樣品經(jīng)鹽酸水解生成氨基葡萄糖，然后在堿性條件下與乙酸丙酮反應(yīng)，生成色原物質(zhì)，再與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)產(chǎn)生紅色，以鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照品，分光光度法測(cè)定其吸光度，進(jìn)而換算出氨基葡萄糖含量[11-12]。

2 結(jié)果與分析

由于軟骨中的CS與蛋白質(zhì)多糖結(jié)合成復(fù)合物，制備CS時(shí)，需通過酶將蛋白質(zhì)水解成多肽或氨基酸，從而將CS釋放出來。但由于酶能水解的肽鍵有一定的特異性，釋放出的CS仍可能連接多個(gè)氨基酸殘基或多肽，在后續(xù)純化中很難除去。如用一步酶解法，CS含氮量難以降低，純度難以提高，所以為了提高CS的純度，可以選擇不同的酶進(jìn)行二次酶解。本研究在傳統(tǒng)的堿提—酶解—醇沉工藝的基礎(chǔ)上，采用二次酶解法，以提高CS的提取效果，并在前期對(duì)堿液提取和第一步酶解工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，就中性蛋白酶的二次酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。

2.1 酶濃度的影響

為了探討不同中性蛋白酶濃度對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)率及其氨基葡萄糖含量的影響，研究中分別采用濃度為0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%的中性蛋白酶溶液進(jìn)行酶解，酶解溫度45℃、pH 7.0，酶解時(shí)間為2 h，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可見，酶濃度對(duì)CS產(chǎn)率的影響不明顯；但對(duì)CS純度的影響較大，其氨基葡萄糖含量隨酶濃度的提高呈上升趨勢(shì)，在酶濃度1.1%時(shí)達(dá)到33.21%，此時(shí)的CS產(chǎn)率為17.51%。繼續(xù)提高酶濃度，氨基葡萄糖含量不再明顯上升。故1.1%為最佳的酶濃度。

2.2 酶解溫度的影響

選取酶濃度為1.1%，酶解溫度分別為40、42、44、46、48、50 ℃，pH 7.0，酶解時(shí)間為 2 h，考察酶解溫度的影響結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，CS產(chǎn)率在17.50%附近小幅變動(dòng)，受酶解溫度的影響不明顯；而CS中氨基葡萄糖含量隨酶解溫度的上升先升高后下降，當(dāng)酶解溫度為44℃時(shí)，氨基葡萄糖含量達(dá)最大值32.87%，此時(shí)的CS產(chǎn)率17.62%。所以44℃為最佳的酶解溫度。

2.3 pH的影響

采用酶濃度為1.1%，酶解溫度為44℃，分別選取pH 為 6.4、6.7、7.0、7.3、7.6、7.9，酶解時(shí)間為 2 h，考察pH對(duì)CS產(chǎn)率和氨基葡萄糖含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

pH對(duì)氨基葡萄糖含量的影響較大，在所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，氨基葡萄糖含量隨pH升高而明顯上升，在pH7.0時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)增大pH，氨基葡萄糖含量迅速下降；而pH對(duì)CS產(chǎn)率影響不大。故7.0為最適pH，此時(shí)的氨基葡萄糖含量32.75%，CS產(chǎn)率17.71%。

2.4 酶解時(shí)間的影響

當(dāng)酶濃度1.1%，酶解溫度44℃，pH7.0，酶解時(shí)間分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 時(shí)，考察酶解時(shí)間的影響，結(jié)果如圖4所示。在所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)條件范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，CS產(chǎn)率變化不明顯，而氨基葡萄糖含量緩慢上升，在酶解時(shí)間2.0h后，氨基葡萄糖含量不再明顯上升。故結(jié)合設(shè)備利用率、酶解成本等因素的考慮，選擇2.0h作為較好的酶解時(shí)間。

采用上述優(yōu)化的酶解條件（酶濃度1.1%、酶解溫度44℃、pH7.0、酶解時(shí)間2.0 h），對(duì)經(jīng)胰酶酶解的產(chǎn)物用中性蛋白酶進(jìn)行二次酶解，產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀干燥，得到CS產(chǎn)品的產(chǎn)率為17.65%，其氨基葡萄糖含量達(dá)33.59%。與只經(jīng)一次酶解比較，CS產(chǎn)率無明顯變化，但氨基葡萄糖含量提高了7.65%。表明二次酶解可以有效提高CS產(chǎn)品的純度和質(zhì)量，滿足市場(chǎng)對(duì)高品質(zhì)CS的需求。

3 結(jié)論

1）以新鮮豬喉軟骨為原料制備CS。在傳統(tǒng)的堿提—酶解—醇沉的基礎(chǔ)上，采用中性蛋白酶對(duì)原料進(jìn)行二次酶解，并對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，得到二次酶解的最佳條件為酶濃度1.1%、酶解溫度44℃、pH7.0、酶解時(shí)間 2.0 h。

2）研究結(jié)果表明，一次酶解得到的產(chǎn)物經(jīng)二次酶解能增加CS中氨基葡萄糖含量7.65%，可以有效提高CS產(chǎn)品的純度和質(zhì)量，滿足醫(yī)藥等領(lǐng)域?qū)Ω咂焚|(zhì)CS的需求。

3）本研究對(duì)更好地利用生豬加工的副產(chǎn)品——豬喉軟骨，做到資源的合理和充分利用；以及為現(xiàn)有CS生產(chǎn)企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益提供了參考。

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