親水色譜法測定甜葉菊葉片中糖苷含量

史一鳴，楊虹，李燕艷，楊天奎

（豐益（上海）生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司，上海 200137）

甜葉菊糖苷（Steviol glycosides）是一種從甜葉菊莖葉中提取的天然甜味劑，被譽(yù)為“世界第三糖源”。與蔗糖、葡萄糖、甜蜜素、阿斯巴甜等甜味劑相比，甜葉菊糖苷具有熱量小、甜度高、口感好、耐高溫、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)[1]。1995年9月18日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)甜葉菊糖苷可以作為“膳食補(bǔ)充劑”進(jìn)行銷售和消費(fèi)。2004年7月6日世界聯(lián)合衛(wèi)生組織正式通過允許甜葉菊糖苷在世界范圍內(nèi)通用的決議[2]。我國在GB 2760-2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定，甜菊糖苷作為甜味劑允許在蜜餞涼果、熟制堅(jiān)果與籽類、糖果、糕點(diǎn)、調(diào)味品、飲料類、膨化食品生產(chǎn)加工中按生產(chǎn)需要適量使用[3]。這些都為甜葉菊糖苷的使用提供了安全證明。

甜葉菊葉片可以用來泡制茶飲，其甜味提取物甜葉菊糖苷耐熱，酸堿條件下的性質(zhì)穩(wěn)定，有防腐等性能，所以可以被應(yīng)用于食品工業(yè)上。其他工業(yè)領(lǐng)域中甜葉菊糖苷也已經(jīng)廣泛被應(yīng)用，例如醫(yī)藥工業(yè)，它可作為矯口劑，應(yīng)用在糖漿劑、散劑、片劑等制作上，還可作為降壓劑、新陳代謝促進(jìn)劑、強(qiáng)壯劑、減肥劑等[4]。日化工業(yè)中，甜葉菊糖苷應(yīng)用在牙膏、漱口液等產(chǎn)品中可掩蔽某些配料的不良味感[5]。

甜葉菊中含有10種甜味成分[6]，因品種及種植環(huán)境的差異，含量有所不同。通常，蛇菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C為含量最多的三種糖苷[1]。

關(guān)于甜葉菊中糖苷含量的測定國內(nèi)外有許多報(bào)道。如分光光度法[7]、薄層色譜法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]、高效液相色譜法[10-15]等。

與其他方法相比，高效液相色譜法具有分辨率高、檢測范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。本文利用超聲萃取技術(shù)、親水色譜原理，建立了一種提取步驟簡單且分析性能優(yōu)異，能同時(shí)測定三種主要糖苷含量的液相色譜方法。經(jīng)過方法學(xué)考察，雜質(zhì)干擾低，分離度良好，回收率高，是準(zhǔn)確可信的方法。用該方法對(duì)5種甜葉菊樣品進(jìn)行測定，得到了準(zhǔn)確的樣品數(shù)據(jù)，對(duì)甜葉菊在食品和醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用具有一定的借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200型高效液相色譜儀（配在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測器）；KuDos SK250H型超聲清洗機(jī)；北京時(shí)代北利離心機(jī)；sartorius CPA225D型十萬分之一天平；METTLER TLOEDO AB204-S型萬分之一天平；BINDER FD115烘箱；IKA A11 basic粉碎機(jī)。

對(duì)照品：蛇菊苷（購自和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，純度＞99%）、萊鮑迪苷A（購自和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，純度＞99%）、萊鮑迪苷C（購自 ChromaDex，純度=87%）。樣品：甜葉菊1號(hào)樣品（生產(chǎn)日期：2010-11-28，產(chǎn)自河北）、甜葉菊2號(hào)樣品（生產(chǎn)日期：2010-11-02，產(chǎn)自安徽）、甜葉菊3號(hào)樣品（生產(chǎn)日期：2009-07-15，產(chǎn)自江蘇）、甜葉菊4號(hào)樣品（生產(chǎn)日期：2010-10-26，產(chǎn)自云南）、甜葉菊5號(hào)樣品（生產(chǎn)日期：2010-11-22，產(chǎn)自云南）。無水乙醇：分析純（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；乙腈：色譜純（德國Merck）；雙蒸水（豐益全球研發(fā)中心分析測試實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 對(duì)照品溶液配制

取蛇菊苷對(duì)照品約50.0 mg，精密稱量，置25 mL容量瓶中，用70%（g/g）乙醇/水溶液溶解，超聲，稀釋至刻度，濃度為2.0 mg/mL；取萊鮑迪苷C對(duì)照品約10.0 mg，精密稱量，置 25 mL容量瓶中，用 70%（g/g）乙醇/水溶液溶解，超聲，稀釋至刻度，濃度為0.4 mg/mL；取萊鮑迪苷A對(duì)照品約62.5 mg，精密稱量，置25 mL容量瓶中，用70%（g/g）乙醇/水溶液溶解，超聲，稀釋至刻度，濃度為2.5 mg/mL。配好的對(duì)照品溶液密封后置于4℃避光環(huán)境中保存。

1.3 樣品制備

取甜葉菊葉片置于50℃避光環(huán)境下烘烤24 h至恒重，然后用粉碎機(jī)打碎，過80目篩，存放在棕色干燥器中。精密稱取干燥的甜葉菊粉500 mg，置50 mL離心管中，精密加入20 mL 70%（g/g）乙醇/水溶液，在超聲儀中超聲30 min。然后取出，6 000 r/min離心5 min，吸取上清液。殘?jiān)性俅尉芗尤?0 mL 70%（g/g）乙醇/水溶液，超聲30 min。取出，6 000 r/min離心5 min。合并兩次上清液于50 mL容量瓶中，用70%（g/g）乙醇/水溶液稀釋至刻度，搖勻。吸取1.5 mL樣品溶液，用0.45 μm針式微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX NH2（4.6×250 mm，5 μm），流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：210 nm，進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相 A：水，流動(dòng)相 B：乙腈，梯度洗脫，流動(dòng)相梯度見表1，獲得的對(duì)照品色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫時(shí)間表（體積比）Table 1 The schedule of gradient elution

2 方法

選取甜葉菊5號(hào)樣品為考察對(duì)象，下文中所述樣品未標(biāo)明即為甜葉菊5號(hào)樣品。

2.1 線性關(guān)系考察

將“1.2”項(xiàng)中蛇菊苷對(duì)照品溶液用70%（g/g）乙醇/水溶液稀釋成 0.032、0.40、0.80、1.2、1.6、2.0 mg/mL 濃度；將“1.2”項(xiàng)中萊鮑迪苷A對(duì)照品溶液用70%（g/g）乙醇/水溶液稀釋成 0.040、0.50、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL濃度；將“1.2”項(xiàng)中萊鮑迪苷C對(duì)照品溶液用70%（g/g）乙醇/水溶液稀釋成 0.0032、0.040、0.080、0.12、0.16、0.20 mg/mL濃度。

吸取10 μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，按“1.4”項(xiàng)所述液相條件測定，得到相應(yīng)色譜峰的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)X進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到蛇菊苷、萊鮑迪苷C和萊鮑迪苷A三種糖苷的回歸方程如表2所示，結(jié)果表明，三者線性良好。

表2 三種糖苷回歸方程Table 2 The regression equations of stevioside，rebaudioside C and rebaudioside A

2.2 精密度試驗(yàn)

吸取樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，記錄蛇菊苷、萊鮑迪苷C及萊鮑迪苷A峰面積。三者的RSD值分別為0.36%，0.87%，0.51%，結(jié)果表明，方法精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取樣品3份，采用上述樣品處理方法做平行測定，所得的蛇菊苷、萊鮑迪苷C及萊鮑迪苷A RSD值如表5所示，三者都小于5%，結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取樣品9份，按高、中、低3個(gè)濃度加入適量的3種對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度3份。三者3個(gè)濃度的加標(biāo)回收率在91%～104%之間，且RSD值小于5%。結(jié)果表明，回收率良好，方法準(zhǔn)確。

3 討論

3.1 提取方法選擇

測定甜葉菊糖苷含量常用高效液相色譜法，其具有分辨率高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，國內(nèi)外有諸多相關(guān)報(bào)道，差別主要集中在提取方法與分析條件兩個(gè)方面。

提取方法上，目前主要有超聲提取法、索氏抽提法[10]、水浴震蕩提取法[11-13]。索氏抽提法耗時(shí)較長，水浴加熱震蕩步驟較為繁瑣，超聲提取法具有高效、快捷、簡單等優(yōu)點(diǎn)，本文選擇了超聲萃取來提取甜葉菊中的糖苷物質(zhì)。

在提取溶劑的選擇上，文獻(xiàn)報(bào)道的有甲醇[10]、乙醇水溶液[11]、沸水[12-13]等。本文對(duì)甲醇、乙醇、水、丙酮、乙醇/水溶液提取效率進(jìn)行單因素試驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)乙醇/水溶液效率最高。純水或者乙醇做提取劑效率欠佳，而甲醇毒性較大。不同濃度的乙醇提取效率也存在明顯差異，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察，60%和70%質(zhì)量濃度對(duì)萊鮑迪苷A提取效率最高。為了進(jìn)一步確定最優(yōu)條件，本文以萊鮑迪苷A含量為考察指標(biāo)，對(duì)超聲提取法中的液料比、乙醇濃度、提取次數(shù)三個(gè)主要因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L4（23），每組做3次平行，結(jié)果取平均值，各因素和水平選取結(jié)果如表3所示。提取時(shí)間通過單因素試驗(yàn)確定，選擇30 min。正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表3 超聲提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Orthogonal test factors and levels of ultrasonic extraction

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test

從表4中可以看出，極差從大到小依次為B＞A＞C，影響提取效果因素主次順序依次為液料比＞乙醇濃度＞提取次數(shù)。提取三次和提取兩次效果相當(dāng)，所以選擇提取二次。得到的最優(yōu)組合為A2B1C1，即70%（g/g）乙醇為提取劑，液料比為40∶1，提取2次，每次30 min。按此最優(yōu)組合條件測得的萊鮑迪苷A含量為4.29%，高于表4中所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，說明該條件提取效率最優(yōu)。

3.2 液相分析方法選擇

分析條件上，常見的色譜柱選擇有C18柱或者氨基柱。國標(biāo)GB 8270—1999《食品添加劑甜菊糖甙》中[14]介紹了測定甜葉菊糖苷純度的液相方法，采用氨基柱，乙腈和水等度洗脫。利用該方法分析甜葉菊葉片糖苷提取液，如圖2所示，糖苷峰和雜質(zhì)峰不能夠完全分離，干擾顯著。嘗試不同的乙腈和水等度洗脫比例，仍無法同時(shí)擺脫雜質(zhì)對(duì)3種糖苷峰型的干擾，等度洗脫模式不能滿足分析需求。

本文選擇氨基柱，其硅膠鍵合氨丙基固定相能與羥基形成氫鍵作用，在乙腈/水為流動(dòng)相的條件下分析極性碳水化合物，是一種親水作用色譜方法。通過對(duì)等度洗脫條件的摸索，改變流動(dòng)相乙腈和水的比例，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)存在疏水性。提高流動(dòng)相中乙腈比例，疏水性雜質(zhì)能相對(duì)較早的被洗脫，而糖苷化合物因?yàn)闅滏I作用仍保留在固定相中。然后降低乙腈比例，提高流動(dòng)相極性，糖苷化合物便被洗脫出來，從而降低了雜質(zhì)的干擾。

在90%乙腈等度洗脫條件下，3種糖苷化合物在40 min內(nèi)沒有出峰，同時(shí)，疏水性雜質(zhì)已經(jīng)基本洗脫出色譜柱，然后，調(diào)整乙腈濃度到75%，3種糖苷化合物即刻快速的洗脫出色譜柱，如圖2所示，分離度良好，達(dá)到了理想的分離要求。從3種糖苷化合物結(jié)構(gòu)分析，萊鮑迪苷A分子中羥基最多，與固定相氫鍵作用最強(qiáng)，所以保留能力最強(qiáng)，因此，在該色譜條件下3種化合物的出峰順序依次為蛇菊苷、萊鮑迪苷C及萊鮑迪苷A。

3.3 甜葉菊樣品測試結(jié)果

對(duì)5種甜葉菊葉片進(jìn)行糖苷含量測定。按“2”項(xiàng)中所述方法對(duì)不同品種葉片進(jìn)行處理，每個(gè)品種取3份。按上述色譜條件分析，測定峰面積，代入回歸方程，計(jì)算出含量，結(jié)果如表5所示。

表5 甜葉菊葉片中三種主要糖苷檢測結(jié)果Table 5 The content of stevioside，rebaudioside C and rebaudioside A in different brands of Stevia Rebaudiana Bertoni

4 總結(jié)

在醫(yī)藥工業(yè)上，蛇菊苷在對(duì)分離的胰島和β細(xì)胞具有直接的促胰島素分泌效應(yīng)，能明顯降低血糖水平，抑制高血糖素分泌[15]，服用甜葉菊糖苷能夠明顯降低午餐后血糖的提高幅度[16]，因此富含蛇菊苷的甜葉菊具有很好的藥用開發(fā)價(jià)值。通過測定糖苷組分含量，1號(hào)、3號(hào)、5號(hào)樣品比較適合藥物開發(fā)。與其他糖苷成分相比，萊鮑迪苷A的口感更接近蔗糖，并且甜度是蔗糖的450倍[1]，所以可以在食品工業(yè)中作為蔗糖的替代品。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看出，2號(hào)、4號(hào)樣品富含萊鮑迪苷A，更合適作為食品添加劑來使用。

本文采用超聲萃取法高效、快捷地提取出甜葉菊葉片中糖苷成分，利用親水色譜原理排除雜質(zhì)干擾，并很好的分離了3種主要的甜葉菊糖苷成分，是一種性能和適用性都較好的分析方法，本方法的建立對(duì)甜葉菊品質(zhì)鑒定具有重要意義。

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[1]鄭建仙.低能量食品[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2001:103-110

[2]丁寧,郝再彬,陳秀華,等.甜葉菊及其糖苷的研究與發(fā)展[J].上海農(nóng)業(yè)科技,2005(4):8-10

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2760-2011食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011:74

[4]倪軍明,李軍平.甜菊糖工業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀與前景[J].廣州食品工業(yè)科技,2004,20(3):156-158

[5]鮑志華,王穎.天然甜味劑-甜菊苷[J].牙膏工業(yè),1999(1):34-37

[6]Jan M C Geuns.stevioside[J].Phytochemistry,2003,64:913-921

[7]項(xiàng)秀珠,郭秀珠,黃品湖.甜菊苷含量的測定方法研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),1996(2):97-99

[8]滕祥金,楊丹,孟滕,等.薄板層析法分析甜葉菊糖苷[J].中國糖科,2007(4):24-31

[9]邵寒娟,胡涌剛,丁亮.毛細(xì)管電泳有效分離測定甜菊糖苷新方法的研究[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2001,17(2):127-130

[10]Makapugay H C,Dnanayakkara N P,Kinghorn A D.Improved highperformance liquid chromatographic separation of the Stevia rebaudiana sweet diterpene glycosides using linear gradient elution[J].Journal of chromatography,1984,283:390-395

[11]Kolb N,Herrera J L,Ferreyra D J,et al.Analysis of Sweet Diterpene Glycosides from Stevia rebaudiana:Improved HPLC Method[J].J A－gric Food Chem,2001,49:4538-4541

[12]Tomas Vanek,Ales Nepovom,Pavel Valocek.Determination of Stevioside in Plant Material and Fruit Teas[J].Journal of food composition and analysis,2001,14:383-388

[13]楊文婷,蔡乾蓉,徐應(yīng)文,等.四川引種甜葉菊的糖苷含量變異及優(yōu)良單株篩選[J].中國糖料,2010(2):27-34

[14]國家輕工業(yè)局,全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心,衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所,等.GB 8270-1999食品添加劑甜菊糖甙[S].北京:中國質(zhì)檢出版社,1999:2-3

[15]Jeppesen P B,Gregersen S,Alstrup K K,et al.Stevioside includes antihyper-glycaemic,and glucagonostatic effects in vivo:studies in the diabetic Goto-Kakizaki(GK)rats[J].Phytomedicine,2002,9(1):9-14

[16]Gregersen S,Jeppesen P B,Hols J J,et al.Antihyperglycemic effects of stevioside in type 2 diabetic subjects[J].Metabolism,2004,53(1):73-76