韓文彪，蔡謹(jǐn)，石瑞，黃磊，徐志南

(1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇南京210037;2.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江杭州310027)

葡萄糖氧化酶生物傳感器的構(gòu)建和性能研究

韓文彪1，2，蔡謹(jǐn)2，石瑞1，黃磊2，徐志南2

(1.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇南京210037;2.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，浙江杭州310027)

目的以固定化葡萄糖氧化酶酶膜構(gòu)建葡萄糖生物傳感器，并對(duì)其性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法優(yōu)化載體及戊二醛交聯(lián)固定化條件，制備性能良好的葡萄糖氧化酶酶膜，研究固定化酶的性能并用于構(gòu)建葡萄糖傳感器。結(jié)果固定化葡萄糖氧化酶的最適催化溫度為40℃、pH為7.0;葡萄糖生物傳感器的響應(yīng)時(shí)間小于20 s，在0～1.5 g·L－1葡萄糖濃度范圍內(nèi)有良好的線性，具有很強(qiáng)抗干擾和穩(wěn)定性。結(jié)論該葡萄糖生物傳感器性能良好，可用于生物樣品中葡萄糖測(cè)定。

葡萄糖氧化酶;固定化;葡萄糖測(cè)定傳感器

葡萄糖的定量測(cè)定在臨床醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域有極其重要的作用?？梢杂梅止夤舛确ā㈦娏鳒y(cè)定法、高效液相色譜法、極譜法及毛細(xì)管電泳法等測(cè)定葡萄糖含量［1］，但是，這些方法有的需要復(fù)雜的前處理過(guò)程，分析速度慢，儀器設(shè)備成本較高，而生物傳感器法由于具有檢測(cè)速度快、選擇性好、體積小、易操作等優(yōu)點(diǎn)，受到眾多研究者的重視［2，3］。目前，葡萄糖生物傳感器的研究日益增多，但是其檢測(cè)范圍普遍較小，響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)且抗干擾能力較弱［4～6］，這些缺點(diǎn)使其在實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中受到限制較多。提高該傳感器的檢測(cè)范圍和靈敏度是亟待解決的問(wèn)題。其中，作為葡萄糖生物傳感器重要組成元件——固定化葡萄糖氧化酶是影響傳感器性能的重要因素［7～10］。

本文篩選了幾種不同類型的材料作為固定化酶的載體，

在不同條件下通過(guò)交聯(lián)法固定葡萄糖氧化酶，以期獲得高比活、高穩(wěn)定性的葡萄糖氧化酶膜。并著重研究基于固定化葡萄糖氧化酶膜的葡萄糖生物傳感器的性能及其應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料葡萄糖氧化酶(GOD，EC 1.1.3.4，TypeⅦfrom Aspergillus niger，100 U·mg－1)購(gòu)于Sigma公司，牛血清白蛋白(BSA)和25%戊二醛購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，聚碳酸酯膜(0.2 μm)購(gòu)于Whatman公司，醋酸－硝酸混合纖維素濾膜(0.22 μm、0.45 μm、0.8 μm)，購(gòu)于上海興亞凈化材料廠，尼龍66微孔濾膜(0.22 μm、0.45 μm、0.8 μm)，購(gòu)于杭州科諾過(guò)濾器材有限公司，雞蛋殼膜自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶的固定化利用打孔器將各種膜切割成直徑為9mm的圓片(面積S=0.635 9 cm2)，分別用0.1 mol·L－1，pH 7.0的磷酸緩沖液浸泡清洗，取出用蒸餾水沖洗干凈，晾干，備用。

依次吸取15 μL葡萄糖氧化酶(GOD)溶液，4 μL牛血清白蛋白(BSA)溶液于1 mL離心管中混合均勻，然后加入1 μL戊二醛溶液迅速混勻，共20 μL。吸取混合液于預(yù)處理過(guò)的膜片上，涂布均勻后置于4℃，靜置反應(yīng)過(guò)夜。取出置于0.05 mol·L－1，pH 7.0磷酸緩沖液中浸泡并振蕩洗去未固定的酶。

1.2.2 酶活測(cè)定酶活性測(cè)定:取35℃預(yù)保溫的1.5 mL溶液A和1.5 mL溶液B，于1 cm比色皿中混合，加入一定量溶液酶或剪碎的固定化酶膜，保溫反應(yīng)2 min，測(cè)定其在500 nm處的吸光值。其中，溶液A:稱取3.5 mg辣根過(guò)氧化物酶和3.5 mg 4－氨基安替吡啉，溶于20 mL 0.2 mol·L－1，pH 7.0磷酸緩沖液中，再加入1 mL 3.0%苯酚。溶液B:6.5%葡萄糖溶液。

葡萄糖氧化酶酶活力單位(U)定義為:每分鐘氧化1 μmol葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和H2O2所需的酶量。

1.2.3 葡萄糖生物傳感器的構(gòu)建將固定化葡萄糖氧化酶膜用“O”型圈緊貼固定于過(guò)氧化氫電極表面，連接信號(hào)處理系統(tǒng)組成葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅?，結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。反應(yīng)池內(nèi)待測(cè)樣品和緩沖液經(jīng)攪拌迅速混勻后，葡萄糖在固定化酶的作用下反應(yīng)生成H2O2，通過(guò)過(guò)氧化氫電極檢測(cè)H2O2濃度，由于底物濃度與H2O2濃度成線性比例關(guān)系，便可以得到葡萄糖濃度。

圖1 葡萄糖傳感器結(jié)構(gòu)示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化條件的優(yōu)化

2.1.1 載體材料對(duì)酶固定化的影響載體種類直接影響固定化酶的活力、底物擴(kuò)散速度及酶的穩(wěn)定性。本文分別以不同材料(尼龍膜0.22 μm、混合纖維素膜0.22 μm、雞蛋膜、聚碳酸酯膜)作為載體進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖2。尼龍作載體材料時(shí)，固定化酶的活力較低;其中以混合纖維素膜為載體材料時(shí)，酶的活力相對(duì)最高，且比較穩(wěn)定，重復(fù)性好。

圖2 載體材料對(duì)酶固定化的影響

2.1.2 載體孔徑對(duì)酶固定化的影響載體的孔徑大小可能會(huì)影響固定化酶的活力。本文分別以0.22 μm，0.45 μm和0.8 μm等不同孔徑的混合纖維素膜作為固定化載體，考察制得的固定化酶效果，結(jié)果見圖3。以孔徑為0.22 μm的材料為載體時(shí)固定化酶活最高，其次是孔徑為0.45 μm的，孔徑為0.8 μm的固定化效果最差，說(shuō)明孔徑大的膜表面可固定化的蛋白量相對(duì)較少，但是以孔徑為0.22 μm的材料為載體時(shí)，構(gòu)建的生物傳感器的分析響應(yīng)較慢，孔徑為0.45 μm的材料為載體時(shí)，固定化酶量和分析響應(yīng)較好，所以，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇0.45 μm的混合纖維素材料為載體。

圖3 混合纖維素膜的孔徑對(duì)酶固定化的影響

2.1.3 戊二醛濃度對(duì)酶固定化的影響以孔徑為0.45 μm的混合纖維素材料為載體，在含2 mg·mL－1GOD和2% BSA的條件下，以不同濃度的戊二醛為交聯(lián)劑，來(lái)考察戊二醛濃度對(duì)酶固定化的影響，結(jié)果見圖4。戊二醛濃度較低時(shí)，隨著戊二醛濃度增大，酶的總活力也在增大，當(dāng)戊二醛終濃度為0.4%時(shí)，酶的活力達(dá)到最大，繼續(xù)提高戊二醛濃度，酶的活力明顯下降。戊二醛濃度太低時(shí)，酶未被充分交聯(lián)固定，而濃度太高反而會(huì)影響酶的結(jié)構(gòu)，從而影響酶活。在以上實(shí)驗(yàn)條件下，戊二醛終濃度為0.4%時(shí)，固定化效果最佳。

圖4 戊二醛濃度對(duì)酶固定化的影響

2.1.4 BSA濃度對(duì)酶固定化的影響以孔徑為0.45 μm的混合纖維素材料為載體，戊二醛濃度為0.4%，GOD的濃度為2 mg·mL－1時(shí)，考察了BSA濃度對(duì)酶固定化效果的影響，結(jié)果見圖5。BSA的濃度對(duì)酶活的影響比較明顯，濃度小于3%時(shí)，隨著BSA濃度增加，固定化酶活也在增加。這可能是加入BSA可有效保護(hù)酶的活性中心并增加酶的固定量。但當(dāng)反應(yīng)體系中BSA濃度大于3%時(shí)，BSA量的增加會(huì)使固定化酶活迅速下降，這可能是過(guò)多的BSA與戊二醛交聯(lián)反而阻礙了酶被充分交聯(lián)固定。本實(shí)驗(yàn)條件下，BSA濃度為3%時(shí)效果最佳。

圖5 BSA濃度對(duì)酶固定化的影響

2.1.5 加入酶量對(duì)酶固定化的影響本文考察固定化酶反應(yīng)體系中加入酶量對(duì)固定化酶的影響，結(jié)果見圖6。總體來(lái)看，酶活力隨著酶量的增加而提高，但當(dāng)酶濃度大于3.75 mg ·mL－1時(shí)，再提高酶濃度，固定化酶的活力變化不明顯，酶膜固定酶量趨于飽和。在本實(shí)驗(yàn)條件下，酶的濃度為3.75 mg ·mL－1時(shí)效果較好。

圖6 酶量對(duì)酶固定化的影響

2.2 固定化葡萄糖氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 溫度對(duì)酶活力的影響溫度對(duì)酶的催化活性有很大的影響，pH=6.0條件下，考察溫度對(duì)游離酶和固定化酶的影響，結(jié)果見圖7。游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)溫度都在40℃左右，與游離酶相比，固定化酶受溫度變化的影響較小，說(shuō)明經(jīng)固定化后，酶的穩(wěn)定性有所提高。

2.2.2 pH對(duì)酶活力的影響酶的催化反應(yīng)都存在于溶液環(huán)境中，pH值會(huì)對(duì)酶產(chǎn)生一定的影響，因此，在40℃條件下，考察pH值對(duì)游離酶和固定化酶的影響，結(jié)果見圖8。游離酶的最適pH在5.5左右，固定化酶的最適pH為7.0左右，且固定化酶受溶液pH變化影響較小，說(shuō)明經(jīng)固定化后，酶的穩(wěn)定性有所提高。

圖7 溫度對(duì)游離酶和固定化酶的影響

圖8 pH對(duì)游離酶和固定化酶的影響

2.2.3 葡萄糖氧化酶的米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax能反映酶的催化動(dòng)力學(xué)。本文在40℃、pH=7.0條件下，測(cè)定了葡萄糖氧化酶的游離酶和固定化酶的Km值和Vmax，結(jié)果見圖9。固定化酶的米氏常數(shù)Km=20.317 mmol·L－1，最大反應(yīng)速度Vmax=0.117 6 mmol·(L· min)－1，游離酶的米氏常數(shù)Km=8.558 mmol·L－1，最大反應(yīng)速度Vmax=0.077 2 mmol·(L·min)－1。說(shuō)明葡萄糖氧化酶固定化后微環(huán)境發(fā)生了變化，酶與底物的親和性稍有下降。

圖9 游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)Km

2.2.4 固定化葡萄糖氧化酶酶膜的保存穩(wěn)定性將固定化葡萄糖氧化酶保存于0.1 M，pH=7.0磷酸緩沖液中，分別置于4℃冰箱和室溫?？疾觳煌瑴囟认鹿潭ɑ富钚缘淖兓闆r，結(jié)果見圖10。4℃保存的固定化酶，前兩周時(shí)間內(nèi)，酶膜活性變化很小，20～40 d內(nèi)酶活力下降比較明顯，保存40 d以后，酶活下降比較緩慢，基本趨于穩(wěn)定，固定化酶的半衰期為60 d左右，具有很好的穩(wěn)定性;室溫環(huán)境下保存的酶膜，前4 d酶活下降明顯，之后酶活緩慢下降，但是在保存到20 d左右時(shí)，酶膜表面開始有霉菌生長(zhǎng)，因此只能測(cè)定到24 d，此時(shí)，酶膜的剩余酶活大約為初始酶活的60%左右，說(shuō)明4℃比室溫更有利于固定化酶的保存，穩(wěn)定性明顯延長(zhǎng)。

圖10 葡萄糖氧化酶膜保存穩(wěn)定性

2.2.5 固定化葡萄糖氧化酶酶膜的熱穩(wěn)定性將游離酶和固定化酶膜分別保存在pH=7.0、0.1 M的磷酸緩沖液中，置于60℃水浴條件下，對(duì)比游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖11。游離酶在該條件下，10 min酶活下降50%左右，半小時(shí)幾乎完全失活，而酶膜在該條件下，2 h后還能保持初始酶活的一半，8 h后僅剩余不到初始酶活的10%。與游離酶相比，固定化酶的熱穩(wěn)定性有明顯的提高。

圖11 60℃時(shí)游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性

2.3 葡萄糖生物傳感器的性能本文以固定化葡萄糖氧化酶酶膜與過(guò)氧化氫電極等組裝成葡萄糖生物傳感器，并對(duì)其對(duì)葡萄糖的響應(yīng)時(shí)間、檢測(cè)范圍，抗干擾能力以及對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品的檢測(cè)準(zhǔn)確性和傳感器的使用穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。

2.3.1 傳感器的響應(yīng)時(shí)間和檢測(cè)限分別配制不同濃度的葡萄糖溶液，用傳感器分別測(cè)定10 s、15 s和20 s時(shí)的響應(yīng)值，考察傳感器的靈敏度和檢測(cè)限，結(jié)果見圖12。該傳感器靈敏度較高，葡萄糖濃度小于3.0 g·L－1時(shí)，15 s時(shí)響應(yīng)值基本達(dá)到穩(wěn)定，20 s達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài);濃度小于1.0 g·L－1時(shí)，10 s時(shí)就能達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。另外，當(dāng)葡萄糖濃度在0～1.5 g·L－1時(shí)，20 s時(shí)的響應(yīng)值與實(shí)際值基本完全一致，說(shuō)明，該傳感器響應(yīng)時(shí)間較短，能準(zhǔn)確測(cè)定0～1.5 g·L－1的葡萄糖濃度。

2.3.2 傳感器的抗干擾能力在實(shí)際使用中，待測(cè)溶液中不僅可能含葡萄糖，還可能含有其他物質(zhì)。本文考察了葡萄糖生物傳感器對(duì)生物樣品中常見成分的抗干擾能力。分別檢測(cè)1.0 g·L－1氯化鉀、1.0 g·L－1氯化鎂、1.0 g·L－1蔗糖、1.0 g·L－1牛血清白蛋白、1.0 g·L－1L－谷氨酸、1.0 g ·L－1尿素、1.0 g·L－1維生素C的響應(yīng)值，以1.0 g·L－1葡萄糖為對(duì)照，結(jié)果見表1。除了對(duì)維生素C有極微弱響應(yīng)外，其他物質(zhì)均無(wú)響應(yīng)，且能準(zhǔn)確測(cè)定葡萄糖的濃度，說(shuō)明該生物傳感器系統(tǒng)有很高的選擇性，抗干擾性很強(qiáng)。

2.3.3 傳感器測(cè)定發(fā)酵液葡萄糖濃度測(cè)定發(fā)酵液樣品中葡萄糖含量是葡萄糖生物傳感器實(shí)際應(yīng)用之一。本文使用自制葡萄糖生物傳感器測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖含量，并與SBA－40C生物傳感分析儀進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。自制葡萄糖生物傳感器的測(cè)定結(jié)果與SBA－40C生物傳感分析儀測(cè)定結(jié)果基本一致。

圖12 傳感器線性關(guān)系

表1 葡萄糖生物傳感器對(duì)干擾物質(zhì)的響應(yīng)

表2 發(fā)酵液中葡萄糖濃度測(cè)定結(jié)果

2.3.4 葡萄糖生物傳感器使用的穩(wěn)定性使用穩(wěn)定性是衡量傳感器的主要性能指標(biāo)之一。本文在室溫條件下，考察了傳感器的基礎(chǔ)活性隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果見圖13。前兩天基礎(chǔ)活性下降比較快，之后酶活逐漸變緩，基本趨于穩(wěn)定，40 d時(shí)的傳感器的基礎(chǔ)活性保留初始酶活的30%，說(shuō)明，在室溫條件下，葡萄糖傳感器有較好的使用穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

綜上所述，以孔徑為0.45 μm的混合纖維素材料為載體，戊二醛、BSA和酶的最佳濃度分別為0.4%、3%和3.75 mg·mL－1時(shí)，可制備高比酶活的固定化葡萄糖氧化酶。固定化葡萄糖氧化酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH為7.0，米氏常數(shù)Km=20.317 mmol·L－1，最大反應(yīng)速度Vmax= 0.117 6 mmol·(L·min)－1。固定化酶具有很好的熱穩(wěn)定性。構(gòu)建的葡萄糖生物傳感器在葡萄糖濃度0～1.5 g·L－1之間，有良好的線性關(guān)系，且響應(yīng)時(shí)間較短，能在20 s內(nèi)迅速達(dá)到平衡。傳感器的選擇性較好，幾乎不受其他物質(zhì)的影響，能準(zhǔn)確的測(cè)定溶液中葡萄糖的含量，并且具有很好的穩(wěn)定性。能較好地測(cè)定發(fā)酵液中的葡萄糖濃度。

圖13 葡萄糖傳感器使用穩(wěn)定性

［1］賈文娟，崔淼，張彥，等.魚鰾膜為基質(zhì)的生物傳感器測(cè)定葡萄糖的研究［J］.分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2011，39 (9):1423－1426.

［2］Wu B，Zhang G，Shuang S，et al.Biosensors for determination of glucose with glucose oxidase immobilized on an eggshell membrane［J］.Talanta，2004，64(2):546－553.

［3］湯琳，曾光明，沈國(guó)勵(lì).基于抑制作用的新型葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅鳒y(cè)定環(huán)境污染物汞離子的研究［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(2):123－126.

［4］Struth B，Eckle M，Decher G，et al.Hindered ion diffusion inpolyelectrolyte/montmorillonitemultilayers:Toward compartmentalized films［J］.Eur Phys J E，2001，6(5): 351－358.

［5］冉旭，冉均國(guó)，茍立，等.殼聚糖凝膠固定葡萄糖氧化酶制備酶電極的工藝［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29 (8):32－34.

［6］王文序，蔡謹(jǐn)，袁駿.葡萄糖氧化酶在氨等離子體改性膜上的固定化［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1997，31(3):399－404.

［7］王勝娥，何潔，袁紅雁，等.酶生物傳感器固定化酶載體的研究［J］.化學(xué)傳感器，2004，24(4):30－34.

［8］Kumar J，D'Souza SF.Inner epidermis of onion bulb scale:As natural support for immobilization of glucose oxidase and its application in dissolved oxygen based biosensor［J］.Biosens Bioelectron，2009，24(6):1792－1795.

［9］Bayramoglu G，Metin Au，Altintas B，et al.Reversible immobilization of glucose oxidase on polyaniline grafted polyacrylonitrile conductive composite membrane［J］.Bioresour Technol，2010，101(18):6881－6887.

［10］Rauf S，Ihsan A，Akhtar K，et al.Glucose oxidase immobilization on a novel cellulose acetate－polymethylmethacrylate membrane［J］.J Biotechnol，2006，121(3):351－360.

Construction and performance study on glucose determination biosensor integrated with immobilized glucose oxidase

HAN Wen-biao1，2，CAI Jin2，SHI Rui1，HUANG Lei2，XU Zhi-nan2
(1.College of Forest Resources and Environment Science，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China; 2.Department of Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)

ObjectiveTo construct glucose determination biosensor with immobilized glucose oxidase and evaluate the characteristic of biosensor.MethodsPrepared immobilized glucose oxidase with good performance by optimizing the immobilized carriers and the immobilization conditions of glutaral cross－linking.The characteristic of immobilized enzyme was studied，and used to construct glucose biosensor.ResultsThe optimal catalytic temperature and pH of immobilization glucose oxidase were 40℃and 7.0，respectively.The response time of glucose biosensor was less than 20 s，the linear range of glucose concentration was 0～1.5 g·L－1.and had high anti－interference and stability.ConclusionThe integrated glucose determination biosensor had good performance and can be used for the determination of glucose in biological samples.

Glucose oxidase;Immobilization;Glucose determination biosensor

book=311,ebook=3

O658.9

A

1672－7738(2012)06－0311－05

國(guó)家“863”項(xiàng)目(2011AA02A114)