朱慧明，魏 剛，張會欣，何奇龍，高學東，齊曉琳，王宏濤

糖尿病性視網膜病變 (DR)是糖尿病微血管病變中最重要的表現，同時也是糖尿病并發(fā)癥在眼部的主要表現［1］。研究表明，高糖狀態(tài)下生長因子在眼內新生血管形成過程中起關鍵性作用，并且能夠引起視網膜微血管滲透性的改變，造成視網膜屏障的破壞，同時能夠誘導血管生成素生成增加，造成視力損壞。芪黃明目膠囊在DR臨床研究中取得了很好的療效［2］，但其機制尚不明確。故本研究以自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj－Ay小鼠為模型，觀察芪黃明目膠囊對DR小鼠視網膜生長因子表達的影響，探討其機制，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 KK/Upj－Ay小鼠 (自發(fā)性2型糖尿病小鼠，用專用飼料喂養(yǎng)3個月即可造模成DR小鼠)36只，體質量30～40 g;C57BL/6小鼠9只，體質量25～30 g。均為SPF級，雄性，12周齡，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物合格證號:0225144。飼養(yǎng)于SPF級動物屏障系統(tǒng)。

1.1.2 試劑與儀器 芪黃明目膠囊，由石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供;血管內皮生長因子 (VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、色素上皮衍生因子 (PEDF)、轉化生長因子－β(TGF－β)、胰島素樣生長因子－Ⅰ (IGF－Ⅰ)引物由上海生工生物技術公司合成;VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ一抗購自Santa Cruz公司。熒光定量 PCR儀，ABI公司產品;凝膠成像分析儀，Biorad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 36只KK/Upj－Ay小鼠按空腹血糖(FBG)水平隨機分為模型組、芪黃明目膠囊高劑量組 (8.32 g生藥/kg)、芪黃明目膠囊中劑量組 (4.16 g生藥/kg)、芪黃明目膠囊低劑量組 (2.08 g生藥/kg)，另設C57BL/6小鼠為對照組，每組9只。采用灌胃給藥，芪黃明目膠囊各組按照相應的劑量給予芪黃明目膠囊，對照組和模型組給予等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)3個月。

1.2.2 小鼠視網膜消化鋪片標本制備 連續(xù)給藥3個月后，把小鼠麻醉，取眼球，固定于10%甲醛液中48 h，分離視網膜，自來水漂洗，放入3%胰蛋白酶消化液37℃孵箱中消化振蕩約3 h，僅剩下一層透明的視網膜血管網，進行HE－PAS染色。

1.2.3 Real Time PCR(qPCR)方法測定 VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ mRNA的表達 取視網膜組織，常規(guī)方法提取RNA，進行Real Time PCR擴增，以GAPDH作為內參照。VEGF引物:上游:5'－TGTCTATCAAGGGAGTGTGTGC－3'，下游:5'－TGGAGTATTTCCGTGACCG －3'，產物片段150 bp;bFGF引物:上游:5'－CGTCAAACTACAACTCCAAGCA －3'，下游:5'－CGTCCATCTTCCTTCATAGCA －3'，產物片段 93 bp;PEDF引物:上游:5'－TGGGTAACCAAGTTTGACTCG －3'，下游:5'－AAGCCGTATCGTAAGATGGC－3'，產物片段116 bp;TGF－β引物:上游:5'－CCGCAACAACGCCATCTATG －3'，下游:5'－TGCTTCCCGAATGTCTGACG－3'，產物片段85 bp;IGF－Ⅰ引物:上游:5'－CTCTTCAGTTCGTGTGTGGAC－3'，下游:5'－AATGCTGGAGCCATAGCCT－3'，產物片段68 bp;GAPDH引物:上游:5'－TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC －3'，下游:5'－TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC－3'，產物片段143 bp。最終結果計為與對照組進行比較后的相對定量值，對照組設置為1。

1.2.4 Western blot法檢測 VEGF、bFGF、PEDF、TGF － β、IGF－Ⅰ蛋白的表達 取視網膜組織，常規(guī)方法提取蛋白質，化學發(fā)光法顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。GAPDH作為內參照。用目的蛋白吸光度值/內參照吸光度值的比值進行比較。

1.3 統(tǒng)計學方法 計量資料以 (±s)表示，采用SPSS 11.5軟件進行ANOVA統(tǒng)計分析和Dunnet t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 視網膜消化鋪片形態(tài)學觀察 對照組正常小鼠視網膜毛細血管分布規(guī)則，走向較直，管徑粗細均勻一致;模型組小鼠視網膜毛細血管網排列紊亂，走向極不規(guī)則，多根毛細血管扭聚成叢，部分毛細血管擴張、管腔粗細不均;芪黃明目膠囊能明顯改善上述變化，以芪黃明目膠囊高劑組最為明顯。

2.2 視網膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ mRNA表達的變化 模型組小鼠視網膜 VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA表達與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)。與模型組比較，芪黃明目膠囊中、高劑量組小鼠VEGF、IGF－Ⅰ mRNA表達顯著減少，芪黃明目膠囊高劑量組小鼠TGF－β mRNA表達顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);而芪黃明目膠囊低、中、高劑量組小鼠bFGF、PEDF mRNA表達與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見表1、圖1)。

2.3 視網膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ蛋白表達的變化 Western blot結果顯示，模型組小鼠視網膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ蛋白表達量與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)。與模型組比較，芪黃明目膠囊中、高劑組小鼠視網膜VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ蛋白表達量顯著減少，差異均有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05);而bFGF和PEDF蛋白表達量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05，見表2、圖2)。

表1 各組小鼠視網膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA表達比較 (±s)Table 1 Comparison of the mRNA expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

表1 各組小鼠視網膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA表達比較 (±s)Table 1 Comparison of the mRNA expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

注:與對照組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.05，★P＜0.01;VEGF=血管內皮生長因子，bFGF=堿性成纖維細胞生長因子，PEDF=色素上皮洐生因子，TGF－β=轉化生長因子－β，IGF－Ⅰ=胰島素樣生長因子－Ⅰ

組別 只數 VEGF bFGF PEDF TGF－β IGF－Ⅰ對照組 3 1.05±0.15 1.51±0.44 1.14±0.16 0.90±0.14 1.54±0.47模型組 3 5.89±1.04△ 4.69±0.56△ 0.28±0.06△ 4.32±0.81△ 5.13±0.58△芪黃明目膠囊低劑組 3 4.23±0.83△ 4.79±1.11* 0.23±0.06△ 3.71±0.40△ 3.44±0.95*芪黃明目膠囊中劑組 3 2.48±0.43★ 5.41±1.49△ 0.29±0.09△ 2.86±0.71△ 2.50±0.85☆芪黃明目膠囊高劑組 3 2.54±0.64★ 4.06±1.23* 0.25±0.09△ 1.96±0.47☆ 2.36±0.78★F 0.000 0.014 0.000 0.000 0.002 21.638 5.459 49.154 17.837 10.065 P值值

表2 各組小鼠視網膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ 蛋白表達的比較 (±s)Table 2 Compariosn of the protein expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

表2 各組小鼠視網膜VEGF、bFGF、PEDF、TGF－β、IGF－Ⅰ 蛋白表達的比較 (±s)Table 2 Compariosn of the protein expression of VEGF，bFGF，PEDF，TGF－β and IGF－Ⅰ in retina of each group

注:與對照組比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.05，★P＜0.01

組別 只數 VEGF bFGF PEDF TGF－β IGF－Ⅰ對照組 3 0.16±0.04 0.12±0.03 0.84±0.12 0.14±0.06 0.16±0.04模型組 3 0.79±0.12△ 0.61±0.08△ 0.34±0.05△ 0.71±0.11△ 0.69±0.11△芪黃明目膠囊低劑組 3 0.65±0.09△ 0.66±0.06△ 0.36±0.06△ 0.63±0.10△ 0.61±0.08△芪黃明目膠囊中劑組 3 0.48±0.07△★ 0.64±0.11△ 0.34±0.07△ 0.49±0.08△☆ 0.44±0.08△★芪黃明目膠囊高劑組 3 0.36±0.06＊★ 0.59±0.09△ 0.32±0.06△ 0.42±0.07△★ 0.33±0.05△★F 值0.000 0.014 0.000 0.000 0.000 27.593 25.447 26.652 20.485 23.251 P值

圖1 各組熒光定量PCR擴增曲線Figure 1 Amplification curve of real－time fluorescent quantitative PCR of each groups

圖2 各組小鼠視網膜Western blot結果Figure 2 Results of Western blot of each group

3 討論

許多因素，如血糖、血壓等對DR的發(fā)生發(fā)展均有重要作用［3］，其發(fā)病機制盡管尚未明確，但隨著細胞生物學和分子生物學技術在DR發(fā)病機制方面的深入研究，已證實VEGF、bFGF、TGF－β、IGF－Ⅰ、PEDF等細胞因子通過一個復雜的網絡系統(tǒng)共同參與了DR的發(fā)生發(fā)展。其中，正常情況下視網膜細胞可產生較低水平的VEGF，用以維持血管穩(wěn)定性和視網膜正常發(fā)育，高血糖狀態(tài)下視網膜局部缺氧導致VEGF表達上調，強力促進內皮細胞增殖，增加血管通透性及誘導新生血管生成，在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［4－5］。TGF－β眼內來源廣泛，DR患者血清中TGF－β水平明顯高于健康人群，并隨病程的延長及眼部病情的加重而增高［6］，可能是促進內皮細胞的增生、黏附及細胞外基質的沉積、激活絲裂原活化蛋白激酶、增加纖維連接蛋白的合成而參與了DR的形成。IGF－Ⅰ是一種多功能細胞增生調控因子，是眼組織正常發(fā)育并完成其生理功能所必需的重要因子，但在糖尿病條件下，IGF網絡系統(tǒng)的作用明顯增強［7］，可以促進視網膜新生血管的形成。本研究結果顯示，自發(fā)性2型糖尿病小鼠視網膜毛細血管網排列紊亂，走向極不規(guī)則，多根毛細血管扭聚成叢，部分毛細血管擴張、管腔粗細不均，提示6個月的KK/Upj－Ay小鼠發(fā)生了DR，采用qPCR和Western blot技術發(fā)現DR小鼠視網膜VEGF、TGF－β、IGF－ⅠmRNA和蛋白表達量均顯著升高，與文獻報道一致［4－7］。芪黃明目膠囊治療3個月后能明顯改善視網膜損傷，延緩視網膜病變的發(fā)展，顯著降低DR小鼠VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ mRNA和蛋白水平，提示芪黃明目膠囊治療DR與下調VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ表達有關。

同時本研究檢測了DR小鼠bFGF和PEDF的表達。bFGF促進DR發(fā)展的具體機制尚不明確，目前認為bFGF可通過旁分泌途徑和自分泌途徑作用于視網膜的各層細胞，并促進其他生長因子的分泌，因而與DR密切相關［8］。PEDF被認為是最有效的天然血管抑制因子，在減少血管滲漏和新生血管形成等病理過程中發(fā)揮著重要作用，研究表明在DR的早、中、晚期PEDF的保護性作用持續(xù)存在［9］。本研究結果顯示，模型組小鼠視網膜bFGF表達較正常小鼠顯著升高，PEDF表達顯著降低，芪黃明目膠囊各組bFGF、PEDF表達與模型組比較無顯著差異，提示芪黃明目膠囊對DR的作用與bFGF、PEDF途徑無關。

芪黃明目膠囊為中藥復方制劑，以化瘀通絡為前提，配合滋潤通補、補氣通絡、熄風解痙、解毒通絡諸法，從絡論治DR的復方中藥，在Ⅲ期臨床試驗中顯示了很好的效果，同時還具有降糖的作用［2］?？傊吸S明目膠囊對2型糖尿病小鼠視網膜發(fā)揮保護作用，可能與其下調 VEGF、TGF－β、IGF－Ⅰ表達有關，但具體機制還需進一步深入研究。

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