糞腸球菌脂磷壁酸對人牙周膜成纖維細胞表達Toll樣受體2及白細胞介素-1β的影響

靳路遠 羅小良 姜艷 謝曉莉

（中南大學湘雅醫(yī)院 口腔科，長沙 410008）

根尖周炎是口腔科的常見病、多發(fā)病，治療的最終目的是使已經(jīng)破壞的根尖周組織包括根尖周的牙周膜和牙槽骨再生并形成新附著，患牙能行使正常功能。根尖周組織再生的基礎(chǔ)是牙周膜成纖維細胞，它在細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與代謝方面具有重要作用，在一定條件下還能分化成骨組織[1]。研究[2]表明：牙周膜成纖維細胞具有一定的免疫潛能，受到微生物致病成分刺激后能分泌多種細胞因子，在牙周和根尖周組織的免疫反應(yīng)中起重要的調(diào)節(jié)作用。

根尖周炎的發(fā)生與根尖生物膜的存在密切相關(guān)，該生物膜是以革蘭陰性厭氧菌及革蘭陽性菌為主的混合體，是根尖周炎發(fā)生的主要病原學基礎(chǔ)。糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）是頑固性或繼發(fā)性根管感染中檢出頻率最高的革蘭陽性細菌之一，也是難治性根尖周炎的主要致病菌[3-4]。其細胞壁有效成分脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）是其主要免疫原，能有效激活免疫系統(tǒng)，誘發(fā)宿主炎癥反應(yīng)。目前認為：跨膜蛋白Toll樣受體2（Toll like receptor 2，TLR2）可將LTA信號直接傳導到細胞內(nèi)，引起一系列細胞免疫反應(yīng)，導致白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等重要炎癥介質(zhì)的分泌[5]。本文通過研究體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細胞（human periodontal ligament cells，HPDLCs）在E.faecalis LTA刺激下TLR2以及IL-1β的表達變化，以闡明E.faecalis LTA在根尖周炎中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

DMEM細胞培養(yǎng)液（Gibco公司，美國）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、pH值為7.2～7.4的PBS緩沖液（自配）；E.faecalis LTA、大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma公司，美國），藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）熒光標記的TLR2抗體、PE熒光標記的IgG同型對照抗體、TLR2中和抗體、IgG同型質(zhì)控抗體（eBioscience公司，美國），IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）96孔試劑盒（深圳晶美公司）。

1.2 HPDLCs體外培養(yǎng)及鑒定

收集12～18歲正畸患者因正畸需要而拔除的前磨牙，刮取牙根中1/3處的牙周膜，剪成0.5 mm2小塊，均勻置于培養(yǎng)瓶底，各組織間隔3 mm，置于37℃、5%CO2、100%濕度的恒溫孵育箱培養(yǎng)，隔天換液。待細胞爬滿瓶底75%～80%時，加入2%胰酶2 mL消化，按1∶3的比例傳代。取第2代細胞進行免疫組織化學鑒定，第5代用于后續(xù)實驗。

1.3 流式細胞術(shù)檢測TLR2的表達

取第5代細胞按每毫升1×106細胞密度接種于六孔板，培養(yǎng)24 h貼壁后，棄原培養(yǎng)液，無菌PBS清洗3次后加入不同的刺激物，依所加抗體的不同分為幾個實驗組。A組：無關(guān)對照組（流式細胞術(shù)要求的對照，指正常細胞內(nèi)加入無關(guān)對照抗體，以消除非特異性的背景染色），正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后加入PE熒光標記的IgG同型對照抗體；B組：正常對照組，正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后加入PE熒光標記的TLR2抗體；C組：LPS作用組，其中C1、C2、C3組分別為含0.1、1、10 μg·mL-1的LPS培養(yǎng)液，作用24 h后加入PE熒光標記的TLR2抗體；D組：LTA作用組，其中D1、D2、D3組分別為含0.1、1、10 μg·mL-1的LTA培養(yǎng)液，作用24 h后加入PE熒光標記的TLR2抗體。每組取3個樣本上機進行流式細胞術(shù)檢測，測定各組TLR2陽性細胞率，比較LTA刺激后及正常細胞TLR2表達的差異。

1.4 ELISA檢測IL-1β的表達

取第5代細胞按每毫升1×105細胞密度接種于96孔板，培養(yǎng)48 h貼壁后，棄原培養(yǎng)液，無菌PBS清洗3次后加刺激物。實驗分組如下：A組為正常對照組，僅加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；B組為陽性對照組，加入含1 μg·mL-1LPS和2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液；C組為實驗組，C1、C2、C3組分別加入含0.1、1、10 μg·mL-1LTA和2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，分別于12、24、48 h吸取細胞培養(yǎng)上清液分裝于EP管中。同樣取上述第5代細胞，加入抗體滴度為1∶100 TLR2中和抗體10 μL，37℃孵育1 h后，再加入含有1 μg·mL-1LTA和2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，吸取上清液分裝于EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?。分別收集上述上清液，按照ELISA操作規(guī)程，各組取100 μL細胞培養(yǎng)液，采用雙抗體夾心法檢測各組IL-1β分泌量。每組設(shè)3個復孔。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，TLR2陽性表達率組間比較采用非參數(shù)多樣本間Kruskal-Wallis H檢驗，IL-1β分泌量采用單因素方差分析Dunnet t檢驗及SNK檢驗。TLR2中和抗體封閉實驗采用兩樣本t檢驗，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)情況

組織塊培養(yǎng)5～10 d后，在倒置顯微鏡下觀察可見組織塊周圍有細胞呈放射狀或偽足狀游出，以組織塊為中心，形成生長暈。細胞呈長梭形，有明顯的細胞分叉，細胞核橢圓形且居中，細胞質(zhì)豐富，細胞貼壁生長。從細胞形態(tài)看所培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。第10代之前的HPDLCs形態(tài)上與原代細胞基本相同，呈束狀漩渦生長，部分細胞可呈復層生長（圖1）。所培養(yǎng)細胞抗波形絲蛋白陽性，抗角蛋白陰性，證明為來自中胚層的間充質(zhì)細胞。

圖 1 第3代HPDLCs 倒置顯微鏡 ×10Fig 1 The third passage of HPDLCs inverted microscope ×10

2.2 TLR2表達情況

TLR2表達情況見表1。正常HPDLCs TLR2陽性表達極低，LTA刺激24 h后，TLR2陽性細胞率明顯上升，與正常對照組及各質(zhì)量濃度LPS組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且隨著LTA質(zhì)量濃度的升高，TLR2陽性細胞率上升，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。不同質(zhì)量濃度LPS刺激24 h后，TLR2陽性細胞率與正常對照組相比，其差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表 1 糞腸球菌LTA誘導HPDLCs TLR2的表達Tab 1 Expression of TLR2 induced by E.faecalis LTA on HPDLCs %，n=3，±s

表 1 糞腸球菌LTA誘導HPDLCs TLR2的表達Tab 1 Expression of TLR2 induced by E.faecalis LTA on HPDLCs %，n=3，±s

注：#C1、C2、C3組間比較，P＞0.05；*D1、D2、D3組與B組比較，P＜0.05；&D1、D2、D3組間比較，P＜0.05。

實驗分組 陽性細胞率A（無關(guān)對照組） 0.16±0.09 B（正常對照組） 0.45±0.04 C1（LPS 0.1 μg·mL-1）1.01±0.03#C2（LPS 1 μg·mL-1）1.50±0.05#C3（LPS 10 μg·mL-1）1.38±0.37#D1（LTA 0.1 μg·mL-1）3.27±0.18*&D2（LTA 1 μg·mL-1）8.36±0.22*&D3（LTA 10 μg·mL-1）11.50±0.39*&

2.3 IL-1β表達情況

IL-1β表達情況見表2。由表2可見：LTA刺激12h后，細胞培養(yǎng)上清液中可檢測到IL-1β分泌，48h內(nèi)持續(xù)上升，不同質(zhì)量濃度組規(guī)律相似；C2、C3組在培養(yǎng)24、48 h時，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；培養(yǎng)時間相同時，C3組IL-1β表達量與C2組相似（P＞0.05）。隨著LTA質(zhì)量濃度的升高，IL-1β表達量升高，C1組在各時間點IL-1β表達量與相同時間點正常對照組相比，其差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；C2、C3組在各時間點與正常對照組相比，IL-1β表達量的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表 2 糞腸球菌LTA誘導HPDLCs IL-1β的表達量Tab 2 Expression of IL-1β induced by E.faecalis LTA on HPDLCs ng·mL-1，n=3，±s

表 2 糞腸球菌LTA誘導HPDLCs IL-1β的表達量Tab 2 Expression of IL-1β induced by E.faecalis LTA on HPDLCs ng·mL-1，n=3，±s

注：#A、B、C1組內(nèi)各時間點間差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05；*C2、C3組內(nèi)24及48 h差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05；&C1組各時間點與A組相比差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05；$各時間點IL-1β分泌量與A組相比差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。

培養(yǎng)時間/h 12 24 48 A（正常對照組）# 0.35±0.04 0.41±0.05 0.41±0.06 B（陽性對照組）# 0.57±0.08 0.59±0.06 0.75±0.10 C1（LTA 0.1 μg·mL-1）#&0.42±0.040.48±0.080.52±0.06 C2（LTA 1 μg·mL-1）*$0.49±0.050.54±0.020.62±0.04 C3（LTA 10 μg·mL-1）*$0.59±0.020.68±0.060.79±0.05實驗分組

采用1∶100滴度的TLR2中和抗體預處理HPDLCs，1μg·mL-1LTA刺激HPDLCs 24 h后，IL-1β表達量為（0.42±0.02）ng·mL-1，而未經(jīng)預處理組的表達量為（0.54±0.02）ng·mL-1，兩組的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.79），提示TLR2中和抗體對LTA引起的IL-1β分泌增多無明顯抑制作用。

3 討論

糞腸球菌是一種革蘭陽性兼性厭氧菌，常見于頑固性或繼發(fā)性根尖周感染中。因其可耐受根管內(nèi)惡劣的生存環(huán)境，對機械預備及藥物沖洗具有抵抗力，且對抗生素有耐藥性，近年來逐漸受到關(guān)注[3-4]。糞腸球菌含有多種毒力因子，如LTA、肽聚糖、透明質(zhì)酸酶等。LTA是其主要免疫原之一。它是一種位于細胞壁的兩性大分子，可通過宿主細胞表面的Toll樣受體激活多種免疫細胞分泌炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。TLR2是Toll樣受體超家族成員中最早被發(fā)現(xiàn)的受體之一，可識別多種病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），如革蘭陽性菌LTA、肽聚糖等，同時，也介導某些革蘭陰性菌的LPS免疫應(yīng)答。IL-1β是炎癥起始階段的重要致炎因子，主要由單核-巨噬細胞及中性粒細胞等分泌，幾乎所有的有核細胞，如成纖維細胞、內(nèi)皮細胞以及平滑肌細胞等均可產(chǎn)生。IL-1β可通過局部免疫調(diào)節(jié)作用引起多種活性反應(yīng)。它能夠加速細胞外基質(zhì)的降解，直接或協(xié)同其他細胞因子間接促進骨吸收、抑制骨形成；能吸引中性粒細胞，引起炎癥介質(zhì)釋放等[6]。在牙周炎及根尖周炎組織中發(fā)現(xiàn)有高水平的IL-1β，是誘導牙周結(jié)締組織破壞和牙槽骨吸收的重要炎癥因子之一[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)：糞腸球菌LTA與大腸桿菌LPS類似，均可導致機體產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)。此結(jié)果與其他學者[8-10]的發(fā)現(xiàn)一致。Draing等[8]比較了金黃色葡萄球菌LTA與大腸桿菌LPS的致炎能力，發(fā)現(xiàn)在聚乙烯培養(yǎng)板上孵育過夜的LTA具有更強的免疫活性，其導致全血細胞分泌IL-8及TNF-α的量是相同濃度LPS的數(shù)十倍之多。LTA是革蘭陽性細菌的重要表面抗原，與革蘭陰性菌LPS類似，可引起宿主細胞炎癥反應(yīng)，還具有介導菌體與宿主細胞的黏附、穩(wěn)定和加強細胞壁等多重作用。本研究還表明：正常HPDLCs的TLR2表達極低，經(jīng)糞腸球菌LTA作用24 h后，TLR2陽性細胞率明顯上升（P＜0.05），并與LTA質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，與Baik等[11]研究結(jié)果近似。Baik等[11]從糞腸球菌細胞壁中提取高純度LTA，可激活鼠巨噬細胞表面TLR2及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表達，引起TNF-α和一氧化氮等前炎性細胞因子的分泌，并具有LTA濃度及時間依賴性。Oca?a等[12]發(fā)現(xiàn)：LTA可使人中性粒細胞分泌IL-6、TNF-α、IL-1β等炎癥因子增加，分泌量與LTA水平呈正相關(guān)。這與本研究結(jié)果相似，即糞腸球菌LTA的刺激可導致HPDLCs IL-1β分泌增加。筆者推測：TLR2中和抗體可能抵消這種作用。但是，本實驗采用TLR2中和抗體預處理細胞，IL-1β分泌量與未處理組并無明顯差異。筆者分析：TLR2途徑可能在LTA引起的炎癥反應(yīng)中起作用，通過髓樣分化因子88（myeloid differentiation 88，MyD88）依賴和非依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑，激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶（IL-1 receptor associated kinase，IRAK）和TNF受體相關(guān)因子（TNF receptor associated factor，TRAF）等信號分子，最終激活NF-κB，引起各種細胞因子的表達，啟動炎癥反應(yīng)[13]；TLR2介導的炎癥信號轉(zhuǎn)導通路除存在于免疫細胞，可能也存在于HPDLCs，從而在根尖周病的局部炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。但TLR2中和抗體對IL-1β分泌的封閉作用未出現(xiàn)有統(tǒng)計學意義的結(jié)果，還需要進一步驗證。后續(xù)實驗將增加TLR2中和抗體的滴度梯度，同時增加LTA及LPS受試組，從多層次對此結(jié)果加以驗證。也可能，TLR2中和抗體對LTA引起的HPDLCs IL-1β分泌增加并不存在封閉作用。Keller等[14]發(fā)現(xiàn)：在成牙本質(zhì)細胞及牙髓成纖維細胞中，LTA并不會引起TLR2及IL-1β的表達增強，相反，在幼稚的樹突細胞中則可檢測到TLR2表達及IL-1β分泌隨LTA濃度增加而增加的情況。Draper等[15]研究表明：B組鏈球菌（一種常見的革蘭陽性細菌）可以引起巨噬細胞TLR2激活，并引起IL-1β分泌增加；而在TLR2基因缺陷的小鼠中，B組鏈球菌不能引起IL-1β顯著表達?？v觀各國學者的研究可以發(fā)現(xiàn)：TLR2信號途徑是否參與了LTA引起的IL-1β分泌增加，不同的研究結(jié)論并不一致，這可能與LTA細菌來源及研究細胞來源不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：糞腸球菌LTA刺激HPDLCs 12 h后即可在細胞培養(yǎng)上清液中檢測到IL-1β，并在48 h內(nèi)穩(wěn)定增加。但孫穎等[16]采用牙齦卟啉單胞菌內(nèi)毒素刺激HPDLCs，IL-1β在24 h分泌達高峰，48 h有所下降；這可能與牙齦卟啉單胞菌內(nèi)毒素的致炎性及毒性較強，作用48 h后HPDLCs死亡或活力減低有關(guān)，而LTA毒性相對較弱，48 h期間HPDLCs依然保持分泌IL-1β的活力。

綜上所述，本研究證實糞腸球菌LTA可以導致HPDLCs表面TLR2表達上調(diào)，并誘導HPDLCs IL-1β分泌增加。由此推測：糞腸球菌LTA可能參與了根尖周病的免疫應(yīng)答。

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