于嵩，王玥，王旭

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖組胚教研室，沈陽 110847）

帕金森病 （Parki nson′sdi sease，PD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，以黑質(zhì)部位的多巴胺能神經(jīng)元變性壞死為主要病理特征。隨著人們生活水平的提高和人口老齡化的加劇，PD已成為第四大致死疾病。因此，解析PD的發(fā)病機(jī)制以及尋找神經(jīng)退行性疾病的治療策略已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。

姜黃素為常用傳統(tǒng)中藥，由于其安全性高且毒副作用小，且具有多方面的藥理作用機(jī)制，近年來廣泛用于治療神經(jīng)退行性疾病。本研究采用 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-m et hyl-4-phenyl-1，2，3，6-t et rahydropyri dine，M PTP）誘導(dǎo)PD小鼠模型，應(yīng)用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、牽引實(shí)驗(yàn)、免疫組化染色、分析和W est ern bl ot檢測(cè)手段，探討姜黃素對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用及其發(fā)生機(jī)制，對(duì)將來實(shí)現(xiàn)姜黃素臨床治療PD提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

5月齡雄性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量均約25 g，隨機(jī)分成3組，對(duì)照組、模型組和姜黃素治療組。對(duì)照組小鼠正常飲食；模型組小鼠腹腔注射M PTP（30 mg/kg）連續(xù)5 d，間隔24 h；治療組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射M PTP（30 mg/kg），隨后連續(xù)7 d腹腔注射姜黃素（50 mg/kg）。

1.2 方法

1.2.1 行為學(xué)檢測(cè)：曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)根據(jù)Teng等［1］的方法，觀察水平運(yùn)動(dòng)力和垂直運(yùn)動(dòng)力2個(gè)指標(biāo)。牽引實(shí)驗(yàn)根據(jù)W ang等［2］的方法記錄牽引評(píng)分。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色：常規(guī)免疫組化染色實(shí)驗(yàn)方法。

1.2.3 體視學(xué)和光密度分析：每只小鼠取腦切片5張，光鏡照相，i pp6.0軟件分析切片上TH和DAT陽性纖維的光密度值和GFAP陽性的細(xì)胞數(shù)量，以每組50張切片的平均值作為各組的數(shù)據(jù)。

1.2.4 W est ern bl ot：常規(guī)W est ern bl ot實(shí)驗(yàn)方法。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13軟件，One-wayANOVA分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素改善小鼠的行為學(xué)異常

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、牽引實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組小鼠的水平運(yùn)動(dòng)力、垂直運(yùn)動(dòng)力以及牽引評(píng)分顯著低于對(duì)照組小鼠。姜黃素給藥7 d后，小鼠的水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)和牽引評(píng)分顯著增加。

2.2 姜黃素保護(hù)M PTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)纖維減少

TH、DAT免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組小鼠中腦紋狀體的多巴胺能神經(jīng)纖維顯著減少；姜黃素治療組小鼠中腦紋狀體內(nèi)的陽性神經(jīng)纖維的數(shù)量明顯增加。光密度分析結(jié)果顯示：模型組小鼠中腦紋狀體內(nèi)TH、DAT免疫陽性產(chǎn)物的光密度值分別減少了43%和91%，姜黃素治療組小鼠中腦紋狀體內(nèi)的TH到DAT標(biāo)記的陽性纖維光密度分別增加到82%和36%。

2.3 姜黃素對(duì)M PTP誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的抑制作用

GFAP免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠黑質(zhì)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增高，姜黃素治療明顯減少了由M PTP激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量（圖1）。體視學(xué)結(jié)果顯示模型組小鼠黑質(zhì)內(nèi)激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組小鼠高出2.5倍，而姜黃素干預(yù)后星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量降到正常對(duì)照組小鼠的1.5倍。

2.4 姜黃素對(duì)M PTP誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）激活的抑制作用

W est ern bl ot結(jié)果顯示：M PTP誘發(fā)了小鼠黑質(zhì)的TNF-α明顯增高，而給予姜黃素治療后，M PTP誘發(fā)的TNF-α的增高得到顯著抑制。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查表明，印度人每天的飲食中包含約200 mg的姜黃素成份，從而使其PD和阿爾茨海默病的患病率明顯要低于其他國家和地區(qū)。已經(jīng)有一些研究證實(shí)姜黃素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制是多方面的［3，4］。在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)姜黃素治療能夠提高模型組小鼠的水平運(yùn)動(dòng)評(píng)分、垂直運(yùn)動(dòng)評(píng)分和牽引評(píng)分；TH和DAT免疫組化染色結(jié)果則證實(shí)姜黃素能保護(hù)M PTP誘導(dǎo)的多巴能神經(jīng)元的減少，這些結(jié)果首先驗(yàn)證了姜黃素具有對(duì)PD多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。

我們的W est ern bl ot結(jié)果證實(shí)小鼠腹腔注射M PTP后使黑質(zhì)內(nèi)TNF-α顯著增高。TNF-α主要是由激活的單核/巨噬細(xì)胞分泌，是具有多種生物活性的多效細(xì)胞因子，主要與炎性反應(yīng)等有關(guān)。同時(shí)，GFAP免疫組化染色結(jié)果顯示模型小鼠黑質(zhì)部位GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量顯著高于對(duì)照組。研究證實(shí)炎癥反應(yīng)參與了多巴胺能神經(jīng)元退行性變［5］，而且有文獻(xiàn)報(bào)道，星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及TNF-α的增多可能參與了腦內(nèi)炎性反應(yīng)過程［6，7］，因此我們認(rèn)為增高的TNF-α可以促進(jìn)星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)。St ri vast ava等［8］報(bào)道了姜黃素具有抗炎和抗氧化作用，我們的W est ern bl ot結(jié)果顯示了姜黃素均能抑制TNF-α的激活；GFAP免疫組化染色結(jié)果證實(shí)姜黃素給藥可以減少模型小鼠黑質(zhì)部位GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。根據(jù)以上結(jié)果，我們推測(cè)：姜黃素通過減少TNF-α的產(chǎn)生，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而使激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)減少，最終起到了保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用。

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