蔡子平，王宏霞

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 啤酒原料研究所，甘肅 蘭州 730070)

啤酒花 (Humulus lupugusL．)又稱蛇麻草、蛇麻花，是蕁麻目大麻科葎草屬植物，是制造啤酒的原料之一［1］。啤酒花能夠賦予啤酒特殊的苦味和獨特的風(fēng)味，并具有一定的防腐性能［2］和醫(yī)藥功能。近年來的研究表明，啤酒花不僅具有鎮(zhèn)定、安神、催眠、殺菌、抗炎和利尿等作用，還具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤和植物雌激素樣作用等多種功效［3－5］。

啤酒花是一種較耐寒不耐熱的植物，主要分布于我國西北地區(qū) (新疆北部、東北、華東及山東、甘肅、陜西等地)。目前，我國啤酒花產(chǎn)量約占全世界的13%，僅次于美國和德國，居世界第3位［6］。我國是世界著名的啤酒花生產(chǎn)和消費大國，隨著啤酒消費和生產(chǎn)的迅速增長對啤酒花的產(chǎn)量和質(zhì)量都提出了更高的要求。品種單一老化、甲酸含量低等問題已成為我國啤酒花種植效益和國際市場競爭力的主要障礙，品種的更新?lián)Q代迫在眉睫。植物組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)作物品種改良方面取得了多方面的成就。啤酒花利用組織培養(yǎng)快繁已有報道，但側(cè)重于病毒分離方面［7］。

組織培養(yǎng)過程中外植體的選擇、滅菌時間以及出芽率的高低及苗子質(zhì)量的好壞將直接影響以后的增殖效果［8］。因此，采用科學(xué)的方法快速篩選出合適的外植體及芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基將對以后試驗的順利進行有著極為重要的意義。本研究以啤酒花側(cè)枝莖段末為試驗材料，對其滅菌時間、外植體木質(zhì)化程度、外源激素配比等因素進行了篩選，旨在找出適合啤酒花芽誘導(dǎo)的最佳外植體及誘導(dǎo)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

啤酒花枝條采自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州試驗地，于2011年5月的早晨采集啤酒花當年生的側(cè)枝帶回實驗室進行處理。

1.2 材料處理

1.2.1 不同滅菌方法對啤酒花外植體滅菌與芽誘導(dǎo)效果的影響

將取回的啤酒花枝條去除葉片，在洗潔精溶液中用軟毛刷刷掉表面灰塵后，用自來水沖洗干凈。在超凈工作臺上，先去掉頂芽，將枝條剪成帶1～2對腋芽、長約3.0～5.0 cm莖段，放置于無菌燒杯中。用75%的酒精浸泡30 s后再以0.1%升汞(HgCl2)+吐溫做滅菌劑，滅菌時間分別設(shè)10，12，14，16 min，共4個處理。滅菌后用無菌水沖洗莖段5～6次，再將莖段兩端剪掉，剪成帶1對腋芽、長1.5～2.5 cm的小段。將經(jīng)消毒的側(cè)芽接入到相同的培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，每處理接種20瓶，每瓶3個，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計出芽率、污染率，分析比較不同滅菌時間處理對啤酒花外植體滅菌與芽誘導(dǎo)效果的影響。

1.2.2 不同木質(zhì)化程度外植體對芽誘導(dǎo)的影響

將外植體側(cè)枝分成3個組，未木質(zhì)化 (側(cè)枝頂芽及以下第1～3個芽位)作為第1組，半木質(zhì)化 (側(cè)枝第4～8個芽位)作為第2組，全木質(zhì)化 (側(cè)枝第9個及以下的芽位)作為第3組。分別以相同的消毒方法將外植體消毒后接入同樣的培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)，每處理接種20瓶，每瓶3個，重復(fù)3次。統(tǒng)計接種的出芽率，分析不同木質(zhì)化程度外植體對芽誘導(dǎo)的影響。

1.2.3 不同外源激素對莖段芽誘導(dǎo)及增殖的影響

保持其他培養(yǎng)條件一致，將幼株莖段按照生理極性分別傾斜插入含有不同濃度IBA、6-BA、IAA相互組合的MS培養(yǎng)基中，所添加的 IAA設(shè)0.1，0.2 mg·L－12個水平;6-BA 設(shè) 0.01，0.05，0.1 mg·L－13 個水平;IAA 設(shè)0.1 mg·L－1單水平。每處理接種20瓶，每瓶3個，重復(fù)3次。統(tǒng)計芽誘導(dǎo)及增殖情況，分析不同外源激素對莖段芽誘導(dǎo)及增殖的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時間對外植體滅菌和芽誘導(dǎo)效應(yīng)

由表1可知，不同滅菌時間對啤酒花外植體的消毒滅菌與芽誘導(dǎo)效果不同。在10～16 min滅菌時間范圍內(nèi)，隨著滅菌時間的延長，外植體污染率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而其死亡率則隨著滅菌時間的延長而依次遞增，其中以滅菌16 min的外植體污染率最低，為30.56%，而死亡率高達33.89%。

表1 0.1%升汞+吐溫滅菌對外植體和芽誘導(dǎo)的效應(yīng)

從表1中還可看出，隨著滅菌時間的延長，外值體芽誘導(dǎo)率呈現(xiàn)先增后降的趨勢，當滅菌14 min時，外植體芽誘導(dǎo)率最高為50.00%。因此以0.1%升汞處理外植體14 min效果最好，既能降低外植體的污染率，又能提高芽誘導(dǎo)率。

2.2 不同木質(zhì)化程度莖段對芽誘導(dǎo)的影響

啤酒花頂端芽因其未木質(zhì)化，分生能力強，生長速度快，因此，其出芽率最高。但由于芽較幼嫩，消毒較困難，消毒時間稍長易出現(xiàn)白化苗，白化率最高。頂芽以下第4～8芽位處于半木質(zhì)化程度，芽誘導(dǎo)的出芽率較高，白化率低，污染也相對較少，比較容易消毒，也適合作為芽誘導(dǎo)的材料。第9位及以下的莖段幾乎完全木質(zhì)化，腋芽的出芽率低且污染率高，很難徹底消毒，因此不適合作為芽誘導(dǎo)的外植體。方差分析結(jié)果 (表2)表明，未木質(zhì)化及半木質(zhì)化莖芽的芽誘導(dǎo)率相對于木質(zhì)化莖段的芽誘導(dǎo)率差異顯著。因此，在啤酒花芽誘導(dǎo)時應(yīng)用未木質(zhì)化及半木質(zhì)化莖段作為外植體。

表2 不同木質(zhì)化程度莖段對芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同外源激素對莖段芽誘導(dǎo)及增殖的影響

將啤酒花莖段接種到添加不同濃度外源激素的MS培養(yǎng)基上15 d后，葉腋處開始萌芽，再過10 d，腋芽開始抽芽，莖段基部開始出現(xiàn)愈傷組織，但愈傷組織未見分化出芽。一般情況下，一個葉腋萌出3～10個芽。莖芽分化所得莖段可以繼續(xù)進行繼代增殖培養(yǎng)，觀測結(jié)果見表3。

表3 不同激素配比對啤酒花莖段芽誘導(dǎo)及增殖的影響

表3顯示，MS培養(yǎng)基能培育出啤酒花莖段的愈傷組織和不定芽，可作為啤酒花莖段組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基;6-BA配合IAA和IBA均能誘導(dǎo)出莖段芽的誘導(dǎo)。6-BA配合IAA均能在莖段基部誘導(dǎo)出愈傷組織，但芽誘導(dǎo)率相對較低。IBA和6-BA配合使用芽誘導(dǎo)率及增殖倍數(shù)較高。綜合分析，處理7誘導(dǎo)率及增殖倍數(shù)均最高，可作為最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合，即 MS+0.2 mg·L－1IBA+0.01 mg·L－16-BA。誘導(dǎo)出的芽生長旺盛粗壯，無褐化現(xiàn)象，芽誘導(dǎo)率為95.2%，增殖倍數(shù)為9.1。

3 小結(jié)與討論

在植物組織培養(yǎng)中，外植體的消毒滅菌一般采用升汞作為滅菌劑進行消毒滅菌，滅菌劑和不同處理時間對外植體滅菌效果有不同影響［9］。啤酒花莖段中空，嫩枝密被柔毛和腺毛，給外植體的消毒滅菌帶來一定困難。如滅菌處理時間太短，啤酒花外植體的內(nèi)生菌難以清除，滅菌不徹底，污染嚴重;但如滅菌處理時間太長，特別是對于幼嫩、未木質(zhì)化的枝條，由于升汞對組織細胞的毒害較大，容易造成其腋芽受傷或者死亡，導(dǎo)致芽誘導(dǎo)率降低。本研究結(jié)果表明，以0.1%升汞處理外植體14 min效果最好，既能降低外植體的污染率，又能提高芽誘導(dǎo)率。

外植體的木質(zhì)化程度直接關(guān)系到腋芽萌發(fā)率［10－12］，啤酒花半木質(zhì)化或未木質(zhì)化莖段光合產(chǎn)物主要用于腋芽的萌發(fā)，營養(yǎng)豐富，含內(nèi)源激素多，有利于離體培養(yǎng)時芽的誘導(dǎo)和生長。本研究結(jié)果表明，啤酒花未木質(zhì)化和半木質(zhì)化莖芽的芽誘導(dǎo)率相對于木質(zhì)化莖段的差異顯著。芽誘導(dǎo)時應(yīng)采用未木質(zhì)化及半木質(zhì)化莖段作為外植體。

植物組織培養(yǎng)的成功與否涉及培養(yǎng)基成分、外植體類型、外植體滅菌條件、外源激素的種類與濃度、光照條件及植物體自身的一些生物學(xué)特性等，其中外源激素的種類、濃度及其配比對組織培養(yǎng)起著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果表明，啤酒花莖段芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.2 mg·L－1IBA+0.01 mg·L－16-BA，誘導(dǎo)出的芽生長旺盛粗壯，無褐化現(xiàn)象，芽誘導(dǎo)率為95.2%，增殖倍數(shù)為9.1。

本研究僅對啤酒花組織培養(yǎng)過程中外植體選擇、外植體滅菌條件及莖段芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基進行研究，要建立啤酒花組織培養(yǎng)體系，還需要對生根培養(yǎng)基及馴化移栽條件進行進一步研究。

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