李為爭(zhēng)，莊 麗，付國(guó)需，楊 雷，李慧玲，原國(guó)輝

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450002

桃蚜Myzus persicae(Sulzer)又稱煙蚜，是一種常年發(fā)生危害嚴(yán)重的世界性害蟲。文獻(xiàn)記載的桃蚜寄主植物多達(dá)400余種［1］，且可傳播100多種植物病毒［2］。20世紀(jì)80年代以來(lái)，為了有效控制桃蚜的危害，化學(xué)殺蟲劑的使用日趨頻繁，單位面積的用藥量不斷攀升，導(dǎo)致桃蚜對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，同時(shí)也引發(fā)了農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題［3］。因此，尋求桃蚜無(wú)公害控制的新技術(shù)與新途徑受到了廣泛關(guān)注，其中利用行為調(diào)控物質(zhì)控制有翅蚜向作物田的遷移、降落和定殖等生命行為，不僅可以減輕蚜蟲的危害，而且能夠抑制病毒病的發(fā)生［4-5］。如嚴(yán)建新和侯有明研究發(fā)現(xiàn)，芳香植物細(xì)葉桉Eucalyptus tereticornia的乙醇提取物對(duì)桃蚜的驅(qū)避率高達(dá)94.17%［6］;Hori研究了13種唇形科芳香植物精油對(duì)于桃蚜的驅(qū)避效果，發(fā)現(xiàn)迷迭香Rosmarinus officinalis和千里香Thymus seryllum精油在1 μL劑量時(shí)即具有驅(qū)避作用，在迷迭香精油彌散的煙草田，桃蚜種群數(shù)量比對(duì)照煙草田下降70%左右，表明非寄主植物氣味影響桃蚜在寄主植物上的降落過(guò)程，具有防治應(yīng)用的潛力［7］。

然而，系統(tǒng)篩選活性芳香植物，并通過(guò)序貫性化學(xué)分析和生物測(cè)定，最終從植物源中找到的活性化合物仍然十分有限。迄今為止，僅發(fā)現(xiàn)水楊酸甲酯是對(duì)蚜蟲具有廣譜驅(qū)避性的物質(zhì)［8-10］。本課題組此前測(cè)定了30種常見(jiàn)芳香植物材料對(duì)有翅桃蚜的驅(qū)避活性，發(fā)現(xiàn)姜科的山奈Kaempferia galanga和蕓香科的廣陳皮Citrus chachiensis粉末的驅(qū)避活性比水楊酸甲酯更強(qiáng)［4］。為了探明其中的驅(qū)避活性成分，本文采用柱層析、GC-MS等技術(shù)鑒定了這些材料中的主要驅(qū)避活性成分，并研究了這些活性成分之間的相互作用，期望為桃蚜高效驅(qū)避劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx和材料

供試?yán)ハx為桃蚜，在春季遷飛高峰期，從河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)的桃園采集有蚜桃葉，放置在市售黃盤中，使有翅桃蚜自由分散;測(cè)定前用軟毛刷收集離開(kāi)桃葉在黃盤中自由活動(dòng)的有翅桃蚜，放入鋪有濕沙的8 mL玻璃小瓶?jī)?nèi)，每瓶30頭，饑餓5 h后用于測(cè)定。供試材料為廣陳皮和山奈，均購(gòu)買于鄭州黃河小商品市場(chǎng)，經(jīng)自然干燥后用FW-100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)在1200 rpm的轉(zhuǎn)速下粉碎10 s，過(guò)40目篩，密封于Parafilm保鮮袋中備用。供試試劑D-檸檬烯和反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯購(gòu)買于蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司，純度分別為90%和98%，柱層析用的有機(jī)溶劑乙醚和石油醚購(gòu)買于天津科密歐試劑公司，分析純。

1.2 儀器設(shè)備

生物測(cè)定裝置為二項(xiàng)選擇式Y(jié)形嗅覺(jué)儀，主臂長(zhǎng)20 cm，支臂長(zhǎng)15 cm，內(nèi)徑為2 cm，兩個(gè)支臂之間的夾角為60°，全套裝置采用1 cm ID的Teflon管進(jìn)行連接。索氏提取器由上海亞榮化玻儀器公司生產(chǎn)。廣陳皮和山奈活性餾分所用分析儀器為DSQⅡ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置DB-5 ms毛細(xì)柱(30 m × 0.25 mm)。

1.3 生物測(cè)定

生物測(cè)定在室溫22±4℃的室內(nèi)條件下進(jìn)行，測(cè)定時(shí)間為每日10∶00～16∶00。測(cè)定時(shí)將處理樣品和對(duì)照樣品滴加在濾紙上，并放置在與Y形嗅覺(jué)儀兩支臂的一側(cè)相連的100 mL三角瓶中，兩支臂空氣入口接活性碳空氣凈化裝置，然后取收集于小瓶中的桃蚜30頭快速接入Y形嗅覺(jué)儀的主臂入口處，打開(kāi)抽氣機(jī)，氣流速度控制在0.3 L/min。并將整套裝置遮黑處理，20 min后觀察記錄進(jìn)入處理支臂和對(duì)照支臂的桃蚜數(shù)量，進(jìn)入支臂10 cm的個(gè)體視為做出了行為選擇反應(yīng)。每次測(cè)定完成后，取出所有離心管，用電吹風(fēng)機(jī)均勻吹掃Y形嗅覺(jué)儀中殘余的氣體，將兩支臂位置調(diào)換，更換材料和蚜蟲后再進(jìn)行下次測(cè)定。為避免學(xué)習(xí)經(jīng)歷對(duì)試驗(yàn)結(jié)果可能造成的影響，每次測(cè)定均使用新挑取的蚜蟲。按下式計(jì)算不同處理對(duì)桃蚜的驅(qū)避率(Repellent percentage，Rp):

式中:Rp為驅(qū)避率，CK為對(duì)照區(qū)的桃蚜數(shù)量，Tr為處理區(qū)的桃蚜數(shù)量，采用SAS軟件的配對(duì)t測(cè)驗(yàn)分析兩支臂桃蚜分布數(shù)量的差異顯著性。采用Trisyono＆Whalon給出的卡方檢驗(yàn)公式判斷二元混合物的拮抗、加成或增效作用［11］。

1.4 廣陳皮和山奈索氏提取物梯度混合測(cè)試

分別稱取廣陳皮和山奈粉末30 g用80目不銹鋼紗網(wǎng)包裹，放入索氏提取器中用重蒸二氯甲烷提取，熱源溫度為42℃，發(fā)生5次虹吸后拆除裝置，將提取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50℃下減壓濃縮至再無(wú)廢液滴下為止。廣陳皮精油得率為3.541%，山奈精油的得率為2.446%。分別用正己烷稀釋淋洗蒸餾瓶中的濃縮物，并定容到10 mL，用于進(jìn)一步的生物活性檢驗(yàn)和柱層析分離。測(cè)定時(shí)，將廣陳皮和山奈的提取物按不同的體積比配制成20 μL的樣品，滴加在濾紙條上作為氣味源，混合樣品(廣陳皮∶山奈，v/v)的比例如下:20∶0、18∶2、16∶4、14∶6、12∶8、10∶10、8∶12、6∶14、4∶16、2∶18、0∶20，共 11 個(gè)處理，分別與潔凈空氣組成配對(duì)置于Y形嗅覺(jué)儀中進(jìn)行生物測(cè)定，每種混合樣品重復(fù)測(cè)定8次。

1.5 柱層析步驟

將Florisil粉在200℃下干燥2 h，冷卻至室溫后與60～90沸程的石油醚混合，填充到50 cm ×1 cm ID的層析柱柱高的2/3處，取廣陳皮或山奈提取物5 mL緩慢滴加到層析柱中，依次取石油醚和乙醚梯度混合溶劑(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10)進(jìn)行淋洗，每次淋洗 10 mL，收集后分別取每餾分20 μL作為氣味源置于Y形嗅覺(jué)儀中，與潔凈空氣配對(duì)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)餾分重復(fù)測(cè)定6次。

1.6 D-檸檬烯及反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯的活性測(cè)定和相互作用分析

由于柱層析過(guò)程使兩種植物粗提物中的化學(xué)成分發(fā)生了再分配，廣陳皮活性餾分的主要成分D-檸檬烯和山奈活性餾分的主要成分反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯在原材料中的含量難以估計(jì)。因此直接取D-檸檬烯和反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯進(jìn)行驅(qū)避活性測(cè)定。分為2 μL D-檸檬烯、2 mg反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯、1 μL D-檸檬烯 +1 mg反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯共3組樣品，溶于20 μL正己烷中作為氣味源，每個(gè)處理重復(fù)測(cè)定10次。

1.7 GC-MS 分析

廣陳皮活性餾分分析條件:GC進(jìn)樣口250℃，分流比10∶1;柱初溫80℃，保留3 min，然后以15℃/min升至240℃，保留15 min;山奈活性餾分分析條件為:進(jìn)樣口280℃，柱初溫80℃，保留1 min，以20℃/min升至250℃，保留25 min。離子源溫度為250℃，界面溫度為250℃，掃描范圍33～400 amu，碎片離子與NIST質(zhì)譜庫(kù)比較確定化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣陳皮和山奈索氏提取物對(duì)桃蚜驅(qū)避的相互作用測(cè)定

不同體積比的廣陳皮和山奈索氏提取物對(duì)桃蚜的驅(qū)避率如圖1所示。不同體積比的混合粗提物對(duì)桃蚜的驅(qū)避百分率之間沒(méi)有顯著性差異(F=0.94，F(xiàn)0.05=1.96)，但單純的廣陳皮粗提物(20/0)和單純的山奈粗提物對(duì)桃蚜的驅(qū)避率分別達(dá)59.42%和65.71%左右，與相應(yīng)的天然材料粉末的驅(qū)避率相當(dāng)，說(shuō)明采用索氏提取器和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的處理過(guò)程沒(méi)有使活性成分損失，提取、濃縮采用的條件是適當(dāng)?shù)?。隨著2種提取物成分的雜化，對(duì)桃蚜的驅(qū)避百分率逐漸下降，以10/10等量混合的樣品對(duì)桃蚜的驅(qū)避活性最低(37.5%)，說(shuō)明廣陳皮和山奈的提取物可能存在著加成作用或微弱的拮抗作用。

圖1 不同體積比的廣陳皮和山奈提取物對(duì)桃蚜的驅(qū)避率Fig.1 Repellence of different volume ratios of C.chachiensis and K.galanga extracts to M.persicae

2.2 廣陳皮和山奈柱層析產(chǎn)物生物活性測(cè)定

廣陳皮和山奈柱層析分離產(chǎn)物的生物測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1和表2。從表1可以看出，廣陳皮洗脫液中，僅餾分Fr.8對(duì)桃蚜具有極顯著驅(qū)避活性(t=5.18，t0.05=2.57;t0.01=4.03)，驅(qū) 避 率 達(dá) 到33.33%，低于圖1中廣陳皮粗提物單獨(dú)使用對(duì)桃蚜的驅(qū)避活性，可能與柱層析過(guò)程稀釋了原始濃縮物有關(guān)。從表2可以看出，在山奈洗脫液中，餾分Fr.6對(duì)桃蚜具有較強(qiáng)的驅(qū)避活性，驅(qū)避率達(dá)到43.75%(t=6.74，t0.05=2.57;t0.01=4.03);另外餾分 Fr.4和Fr.9也具有顯著的驅(qū)避活性，驅(qū)避率分別達(dá)到26.26%和18.89%。餾分Fr.8表現(xiàn)為微弱的引誘活性，且也達(dá)到了顯著性水平(t=3.48，t0.05=2.57;t0.01=4.03)，說(shuō)明山奈驅(qū)避桃蚜的揮發(fā)性物質(zhì)可能是一組極性差別較大的混合物，且有可能與引誘物質(zhì)共存于同一材料，驅(qū)避反應(yīng)的行為輸出是桃蚜對(duì)這些復(fù)雜混合物進(jìn)行綜合評(píng)判的結(jié)果。

表1 廣陳皮柱層析洗脫液不同餾分對(duì)桃蚜的驅(qū)避活性Table 1 The repellent activities of the C.chachiensis fractions rinsed with different volume ratios of petroleum ether and diethyl ether

表2 山奈柱層析洗脫液不同餾分對(duì)桃蚜的驅(qū)避活性Table 2 The repellent activities of K.galanga fractions rinsed with different volume ratios of petroleum ether and diethyl ether.

2.3 廣陳皮和山奈活性洗脫液GC-MS分析

取廣陳皮提取物中具有驅(qū)避活性的餾分Fr.8進(jìn)行GC-MS分析，總離子流圖和成分列表分別見(jiàn)圖2和表3。從表3可以看出，廣陳皮活性洗脫液中共鑒定出9種成分，含量最大的是蕓香科的特征性揮發(fā)物D-檸檬烯(39.07%)，其次是對(duì)異丙基-1-甲基苯乙醛(21.86%)，二者合計(jì)占總揮發(fā)物成分的61%左右，其他成分所占比例較低。取山奈提取物中具有驅(qū)避性的餾分 Fr.6、Fr.4和 Fr.9合并起來(lái)進(jìn)行分析，總離子流圖和成分列表分別見(jiàn)圖3和表4。從表4可以看出，山奈活性餾分中共鑒定出21種成分，含量最大的是姜科植物的特征性揮發(fā)物反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(70.22%)和順-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯(19.55%)，這兩種順?lè)串悩?gòu)體合計(jì)占總揮發(fā)物量的89.77%。推測(cè)D-檸檬烯和反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯可能具有驅(qū)避桃蚜的活性。但由于柱層析過(guò)程中化學(xué)成分在不同餾分之間發(fā)生了再分配， 這些主成分在原始材料提取物中的含量是未知的。

圖2 廣陳皮活性洗脫液GC-MS分析總離子流圖Fig.2 Total ion chromatography of the active fractions of C.chachiensis extracts

表3 廣陳皮活性洗脫液GC-MS成分鑒定結(jié)果Table 3 The peak numbers，retention time，relative content of the active components contained in the C.chachiensis active fractions analyzed by GC-MS

圖3 山奈活性洗脫液總離子流圖Fig.3 Total ion chromatography of active fractions of K.galangal extracts

表4 山奈活性洗脫液GC-MS分析結(jié)果Table 4 The peak numbers，retention time，relative content of the active components contained in the K.galanga active fractions analyzed by GC-MS

圖4 D-檸檬烯和反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯及其二元混合物對(duì)桃蚜的驅(qū)避活性測(cè)定Fig.4 Repellence bioassay of D-limonene，ethyl 4-methoxycinnamate，and their binary blend to M.persicae

2.4 廣陳皮和山奈活性餾分的主要成分驅(qū)避活性測(cè)定

由于鑒定出的多種物質(zhì)難以購(gòu)置，且D-檸檬烯和反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯分別是廣陳皮和山奈的主要揮發(fā)物成分，因此僅測(cè)試了這兩種成分對(duì)桃蚜的驅(qū)避作用，結(jié)果如圖4所示。從中可以看出，D-檸檬烯和反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯對(duì)桃蚜均具有極顯著驅(qū)避作用(t0.05=2.26，t0.01=3.25)。將二者的劑量分別減半并組成二元混合物，發(fā)現(xiàn)其仍對(duì)桃蚜表現(xiàn)為極顯著的驅(qū)避作用。從驅(qū)避百分率的比較上看，D-檸檬烯和反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯混合物的驅(qū)避百分率期望值為72.20%，實(shí)測(cè)值只有44.30%(χ2=0.11 ＜=3.84)，故表現(xiàn)為加成作用，與上述粗提物混合測(cè)試的結(jié)果基本一致。

3 討論

當(dāng)前的昆蟲化學(xué)生態(tài)研究一般集中在昆蟲與自然生長(zhǎng)的寄主植物或非寄主植物的化學(xué)信息通訊方面。然而，從創(chuàng)制害蟲行為調(diào)控劑方面來(lái)看，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步擴(kuò)大活性物質(zhì)的篩選范圍，尤其是人類經(jīng)過(guò)幾千年已經(jīng)篩選出的用于調(diào)料和醫(yī)藥等用途的芳香植物，這些植物一般含有豐富的精油，嗅感濃重。我們通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，在30種芳香植物材料對(duì)桃蚜驅(qū)避活性的系統(tǒng)篩選中，廣陳皮、山奈和白芷的驅(qū)避效果尤其顯著［4］，但對(duì)其中的活性成分沒(méi)有定性。本文選取廣陳皮和山奈作為供試材料，通過(guò)索氏提取、濃縮和一系列柱層析分離步驟，結(jié)合GC-MS分析，證實(shí)了廣陳皮和山奈的索氏提取物對(duì)桃蚜具有較強(qiáng)的驅(qū)避作用，但二者不同體積比混合物的活性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異，且等體積比混合的樣品驅(qū)避活性最差，說(shuō)明兩種提取物存在加成效應(yīng)或者微弱的拮抗作用。進(jìn)一步采用乙醚和石油醚梯度混合的淋洗劑對(duì)二者進(jìn)行柱層析分離，發(fā)現(xiàn)廣陳皮中僅石油醚∶乙醚 =3∶7的洗脫液(表1中的Fr.8)具有極顯著驅(qū)避作用;山奈中活性最強(qiáng)的餾分是石油醚和乙醚等量混合的溶劑的洗脫物(表2中的Fr.6)，另外還有其他一些驅(qū)避活性較弱的餾分。GC-MS分析表明，廣陳皮活性洗脫液中含量最大的是D-檸檬烯，山奈活性餾分中含量最大的是對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯的兩種異構(gòu)體。采用純化合物進(jìn)行測(cè)定證實(shí)了二者對(duì)桃蚜具有極顯著的驅(qū)避活性，且二者混合表現(xiàn)為加成效應(yīng)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的驅(qū)避物質(zhì)D-檸檬烯大量存在于蕓香科的柑橘類植物果皮中，多食性害蟲桃蚜也可以利用柑橘類作為寄主植物，但主要是集中在嫩葉上危害［1］，造成桃蚜選擇寄主不同部位的原因可能與嫩葉中D-檸檬烯的含量低于果皮有關(guān)，有待進(jìn)一步研究予以證實(shí)。與此類似，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜科植物山奈揮發(fā)物的主要成分對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯大量存在于塊根而不是地上部分，說(shuō)明驅(qū)避害蟲的天然產(chǎn)物資源可以來(lái)自非寄主植物，也可以來(lái)自同一寄主植物上不同的部位。后者更應(yīng)當(dāng)受到重視，因?yàn)檫@種驅(qū)避性是在來(lái)自寄主的大量引誘性物質(zhì)的背景下顯現(xiàn)出來(lái)的，與農(nóng)作物田應(yīng)用驅(qū)避劑的情況很相似。在寄主植物本身中發(fā)現(xiàn)桃蚜驅(qū)避性物質(zhì)并非首例，例如，野生馬鈴薯Solanum berthaultii和栽培種馬鈴薯S.tuberosum具有A型和B型兩種腺毛，這些腺毛中倍半萜類的含量存在較大差異，盡管野外觀察到桃蚜可以在兩種馬鈴薯上危害，但對(duì)馬鈴薯植株葉片上不同部位具有選擇性［12］。此外，廣陳皮粗提物和山奈粗提物對(duì)桃蚜的驅(qū)避百分率分別達(dá)59.42%和65.71%左右，而特征性氣味物質(zhì)D-檸檬烯和反-對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯對(duì)桃蚜的的驅(qū)避百分率分別達(dá)到50.77%和43.53%，這說(shuō)明盡管廣陳皮與山奈粗提物之間以及二者的主成分之間均表現(xiàn)為加成效應(yīng)，但山奈的主成分驅(qū)避活性與粗提物相比下降了22.18%，某些次要成分例如山奈成分中保留時(shí)間為7.17 min的第10號(hào)峰(肉桂酸乙酯)可能具有增效作用，該物質(zhì)相對(duì)含量較大且與主成分結(jié)構(gòu)相似。

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