龐鈺瑩，岳文斌，于雪靜，李鵬飛，孟金柱，劉巖，李曉明，黃洋，任有蛇，呂麗華

（1．山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801；2．山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801）

綿羊卵巢卵泡從原始卵泡形成開(kāi)始就進(jìn)入了一個(gè)卵泡生長(zhǎng)與閉鎖相交織的過(guò)程，這一過(guò)程貫穿雌性動(dòng)物繁殖的始終。而卵泡的生長(zhǎng)和排卵需要顆粒細(xì)胞正常的生長(zhǎng)增殖和功能表達(dá)，這有利于卵母細(xì)胞的成熟［1～3］，在這個(gè)過(guò)程中，F(xiàn)SH和胰島素是促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和發(fā)揮生理功能的重要因子［4］。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)無(wú)血清條件下綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)，研究不同濃度的FSH和胰島素對(duì)顆粒細(xì)胞增生及雌激素分泌的影響，在研究中排除了血清中未知因素干擾，確定了綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)最適宜的FSH和胰島素濃度，為雌性動(dòng)物卵巢功能的檢測(cè)、卵巢疾病引起的不孕癥治療以及動(dòng)物生殖提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

選取清徐縣屠宰場(chǎng)成年健康母羊作為研究對(duì)象，動(dòng)物宰殺后采集卵巢。

MEM 培養(yǎng)液、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）、兩性霉素 B（Fungizone）、4－羥乙基哌嗪乙磺酸（4－（2－h(huán)ydroxyerhyl）piperazine－1－erhaesulfonic acid，HEPS）、非必需氨基酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、雄激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子（Independent Games Festival，IGF）、胰島素、促卵泡素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）、臺(tái)盼藍(lán)、氫氧化鈉、Sheep Estradiol Elisa kit、雙抗等。

1．2 方法

1．2．1 體外培養(yǎng)試驗(yàn)器具的處理

試驗(yàn)所用玻璃器皿、膠塞和塑料制品，必須經(jīng)嚴(yán)格的酸堿處理程序后，最后用自來(lái)水和雙蒸水各沖洗3次，烘干后待用。

1．2．2 顆粒細(xì)胞的收集

從滅菌的DPBS中取出卵巢，沖洗干凈，用眼科剪剪取卵泡，放入4℃無(wú)菌的培養(yǎng)液中，置于超凈臺(tái)。將卵泡一剪兩半，用刮刀輕輕刮卵泡內(nèi)壁，將顆粒細(xì)胞刮入盛有培養(yǎng)液的小表面皿中。離心棄上清，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，此懸浮細(xì)胞即為試驗(yàn)用顆粒細(xì)胞。

1．2．3 顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)

將稀釋顆粒細(xì)胞，加于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約2×104個(gè)活細(xì)胞。分別加入不同濃度的FSH和胰島素。未添加FSH和胰島素的孔用等量培養(yǎng)液代替，每孔為200μL體系。培養(yǎng)第7d，用DPBS（Dulbecco PBS）胰蛋白酶消化并細(xì)胞計(jì)數(shù)。每孔抽取170μL細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管并置于－20℃冰箱中待測(cè)激素。

1．2．4 雌激素測(cè)定

選用綿羊雌二醇放射免疫測(cè)定試劑盒對(duì)激素濃度進(jìn)行測(cè)定。

1．2．5 雌激素濃度計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品5000、1000、300、50、0ng·L－1為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；根據(jù)樣品OD值在曲線(xiàn)圖上得出相應(yīng)雌激素含量，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即得培養(yǎng)液雌激素濃度。

1．2．6 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果用3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用Excel 2007作圖，SPSS 11．03（Statistic Package for Social Science）對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性模型分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)168 h細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

對(duì)FSH的作用進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。與未加FSH的對(duì)照組相比，培養(yǎng)液加入不同濃度FSH，體外培養(yǎng)7d，顆粒細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0．01）?？梢?jiàn)，F(xiàn)SH對(duì)綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

圖1 FSH對(duì)顆粒細(xì)胞數(shù)目的影響Fig．1 Effects of FSH on the number of granulosa cells

當(dāng)FSH濃度為0．1μg·L－1，培養(yǎng)體系中顆粒細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0．05）；當(dāng)FSH濃度為5 μg·L－1，顆粒細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組和FSH濃度為0．1μg·L－1、0．5μg·L－1和1μg·L－1的培養(yǎng)組（P＜0．01）；當(dāng)FSH濃度為25μg·L－1，顆粒細(xì)胞數(shù)目與其他組相比有上升趨勢(shì)，但與FSH濃度為5μg·L－1的培養(yǎng)組差異不顯著。這說(shuō)明FSH濃度為5μg·L－1時(shí)，顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)條件最優(yōu)。

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)培養(yǎng)體系中添加胰島素時(shí)，與對(duì)照組相比（培養(yǎng)體系不加胰島素），隨著胰島素濃度增加，顆粒細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0．01），且兩兩之間差異極顯著。可見(jiàn)，胰島素對(duì)綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。

圖2 胰島素對(duì)顆粒細(xì)胞數(shù)目的影響Fig．2 Effects of insulin on the number of granulosa cells

2．2 綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)168 h雌激素水平的測(cè)定

綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)168h，不同濃度FSH對(duì)雌激素分泌量的作用效果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著FSH濃度的增加，雌激素濃度呈上升趨勢(shì)；與對(duì)照組（培養(yǎng)體系不加FSH）相比，當(dāng)FSH濃度為0．1μg·L－1，培養(yǎng)液雌激素濃度顯著提高（P＜0．05）；當(dāng)FSH濃度增加為0．5 μg·L－1以上時(shí)，培養(yǎng)液雌激素濃度都顯著高于對(duì)照組（P＜0．01）；當(dāng)FSH 濃度為5μg·L－1，培養(yǎng)液雌激素濃度最高，與FSH濃度為25μg·L－1的培養(yǎng)組相比，差異雖不顯著，但雌激素分泌水平呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明FSH濃度為5μg·L－1時(shí)，顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)條件最優(yōu)，這與顆粒細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果相吻合。

圖3 FSH對(duì)雌激素分泌量的影響Fig．3 Effects of FSH on estradiol production

在不同濃度的胰島素作用下，顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)168h，對(duì)雌激素的濃度進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，隨著胰島素濃度增加，顆粒細(xì)胞雌激素分泌量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)胰島素濃度為1 μg·L－1時(shí)，培養(yǎng)液雌激素濃度顯著提高（P＜0．01）；當(dāng)胰島素濃度增加為10μg·L－1時(shí)，培養(yǎng)液雌激素濃度繼續(xù)升高，但與胰島素濃度為1μg·L－1的培養(yǎng)體系相比，培養(yǎng)液雌激素濃度差異不顯著。表明胰島素濃度為1μg·L－1時(shí)，顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)條件最優(yōu)。

圖4 胰島素對(duì)雌激素的影響Fig．4 Effects of insulin on estradiol production

3 討論

3．1 FSH和胰島素的作用機(jī)理

FSH是在有節(jié)律的下丘腦促性腺激素釋放激素刺激下，由垂體前葉合成和分泌的一種糖蛋白激素。FSH能夠提高哺乳動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞增殖活性。顆粒細(xì)胞中有FSH受體，當(dāng)受體與FSH結(jié)合時(shí)，可以激活cAMP系統(tǒng)，提高芳香化酶的活性［6］，誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞雌激素的產(chǎn)生［7，8］，從而提高雌激素的分泌量等［9～11］。本研究通過(guò)對(duì)綿羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)，對(duì)顆粒細(xì)胞數(shù)和雌激素濃度測(cè)定結(jié)果表明，在對(duì)照組中，顆粒細(xì)胞數(shù)處于一定基數(shù)，雌激素水平也較低，增加FSH濃度可顯著提高培養(yǎng)液中顆粒細(xì)胞數(shù)和雌激素濃度。

胰島素對(duì)顆粒細(xì)胞的作用是多方面的［12，13］，其可能的機(jī)制之一是通過(guò)與胰島素樣生長(zhǎng)因子－I（IGF－I）受體結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞代謝。在試驗(yàn)中，對(duì)胰島素濃度設(shè)定了3個(gè)梯度，隨著胰島素濃度升高，顆粒細(xì)胞數(shù)和雌激素濃度呈上升趨勢(shì)，進(jìn)一步證明了胰島素對(duì)卵泡生長(zhǎng)的重要作用。

3．2 FSH和胰島素對(duì)顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

本試驗(yàn)證明在無(wú)血清條件下，F(xiàn)SH和胰島素對(duì)顆粒細(xì)胞增殖和雌激素分泌存在劑量效應(yīng)關(guān)系。在無(wú)FSH或胰島素作用下，顆粒細(xì)胞聚集生長(zhǎng)的細(xì)胞團(tuán)比較少，雌激素的分泌量增加也較低。當(dāng)FSH為5μg·L－1時(shí)，雌激素的分泌量最高。當(dāng)胰島素濃度為10μg·L－1，培養(yǎng)液雌激素濃度最高，與1μg·L－1的實(shí)驗(yàn)組差異不顯著。因此對(duì)于培養(yǎng)體系而言，胰島素為1μg·L－1時(shí)，為最佳的體外培養(yǎng)濃度。本研究發(fā)現(xiàn)繼續(xù)增加FSH和胰島素的濃度，反而會(huì)降低顆粒細(xì)胞的功能，這與黃洋等研究結(jié)論一致［14］。也有研究表明，在無(wú)血清條件下高濃度的FSH會(huì)降低牛的卵泡顆粒細(xì)胞分泌雌激素的能力［8］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，部分綿羊卵泡顆粒細(xì)胞有聚集生長(zhǎng)的特性，能形成胚胎干細(xì)胞團(tuán)樣集落，這與牛、小鼠、豬的卵巢卵泡顆粒細(xì)胞體外生長(zhǎng)的特性很相似［15～17］，但是否具有干細(xì)胞特異性還需要進(jìn)一步研究。

［1］朱麗，郭成志，鄧思君，等．豬卵巢顆粒細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47（4）：21－22．

［2］Lihua Lv，Wenbin Yue，Wenzhong Liu，et al．Effects of sperm capacitation treatments and in vitro culture systems on development of in vitro fertilized embryos derived from prepubertal Boer goat oocytes［J］．Asian Australian Journal of Animal Sciences，2009，22 （7）：969－976．

［3］Lihua Lv，Wenbin Yue，Wenzhong Liu，et al．Effect of oocyte selection，estradiol and antioxidant treatment on in vitro maturation of oocytes collected from prepubertal Chinese Boer goats［J］．Italian Journal of Animal Sciences，2010，9（11）：50－54．

［4］Argov N，Arav A，Sklan D．Number of oocytes obtained from cows by OPU in early，but not late lactation increased with plasma insulin and estradiol concentrations and expression of mRNA of the FSH receptor in granulosa cells［J］．Theriogenology，2004，61（5）：947－962．

［5］Sen A，Bettegowda A，Jimenez－Krassel F，et al．Cocaine－and amphetamine－regulated transcript regulation of follicle－stimulating hormone signal transduction in bovine granulosa cells［J］．Endocrinology 2007，148：4400－4410．

［6］王鋒．卵泡生長(zhǎng)發(fā)育成熟及其內(nèi)分泌調(diào)控［J］．國(guó)外獸醫(yī)學(xué)——畜禽疾病，1994（1）：1－8．

［7］李鵬飛，岳文斌，李富祿，等．CART對(duì)豬卵巢卵泡顆粒細(xì)胞雌激素產(chǎn)生的影響［J］．畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43（12）：1879－1886．

［8］高慶華，蔣超祥，韓春梅．FSH和胰島素對(duì)牛卵泡顆粒細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的影響［J］．中國(guó)草食動(dòng)物，2004，24（4）：16－18．

［9］Hughes F M Jr，Gorospe W C．Biochemical identification of apoptosis（programmed cell death）in granulose cells：evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia［J］．Endocrinology，1991，129（5）：2415－2422．

［10］Sen Aritro，Lihua Lv，Nora Bello，et al．Cocaine and amphetamine－regulated transcript（CART）accelerates the temination of FSH－induced ERK1／2and AKT activation by regulating the expression and degradation of specific MAP kinase phosphatases［J］．Mol endocrinol，2008，22：2655－2676．

［11］Lv Lihua，F(xiàn)ermin Jimenez－Krassel，Aritro Sen，et al．Evidence supporting a role for cocaine and amphetamine regulated transcript（CART）in control of granulosa cell estradiol production associated with dominant follicle selection in cattle［J］．Biology of Reproduction，2009，81：580－586．

［12］Torner H，Brüssow K P，Alm H，et al．Mitochondrial aggregation pattern and activity in porcine oocytes and apoptosis in surrounding cumulus cells depends on the stage of pre－ovulatory maturation［J］．Theriogenology，2004，61（9）：1675－1689．

［13］龔衍，李尚為，樊偉．胰島素促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖［J］．四川生理科學(xué)雜志，2008，30（2）：64－65．

［14］黃洋，孫晉艷，李鵬飛，等．綿羊卵泡顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］．山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：161－163．

［15］Gutierrez C G，Campbell B K，Webb R．Development of a long－term bovine granulosa cell culture system：induction and maintenance of estradiol production，response to follicle stimulating hormone，and morphological characteristics［J］．Biol Reprod，1997，56：608－616．

［16］王妍，趙曉娥，楊培生，等．小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的體外培養(yǎng)［J］．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，35（8）：12－14．

［17］孫晉艷，黃洋，張航，等．FSH對(duì)體外培養(yǎng)豬卵巢顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的影響［J］．山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（5）：465－470．