真鱈魚骨明膠的提取工藝及性質(zhì)研究*

王珊珊，單銀銀，李志皓，喬若瑾，李八方

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266003)

真鱈魚骨明膠的提取工藝及性質(zhì)研究*

王珊珊，單銀銀，李志皓，喬若瑾，李八方

(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島，266003)

以真鱈魚骨為原料對(duì)其明膠的提取工藝進(jìn)行了研究。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)探討HCl濃度、酸處理時(shí)間、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)魚骨明膠得率的影響。結(jié)果表明:HCl濃度4%，酸處理時(shí)間18 h，提取溫度70℃，提取時(shí)間8 h，明膠提取率最高，達(dá)98.02%。明膠在235 nm處有最大吸收。在上述提取條件下，得到的明膠經(jīng)紅外光譜檢測(cè)失去三螺旋結(jié)構(gòu)，在掃描電鏡觀察下明膠具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

真鱈魚骨，明膠，提取，得率

明膠是一種重要的高分子蛋白質(zhì)，含有除色氨酸之外的所有必需氨基酸。明膠是用動(dòng)物(主要是豬和牛等)的結(jié)締組織(如皮、骨、筋腱、韌帶等富含膠原的組織)經(jīng)酸法或堿法預(yù)處理后抽提制成。明膠因具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和較好的生物相容性，因而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、照相材料等領(lǐng)域，近年來(lái)全球?qū)γ髂z的需求量持續(xù)增長(zhǎng)。隨著瘋牛病和口蹄疫等人畜共患疾病的出現(xiàn)，傳統(tǒng)明膠的安全性受到廣泛質(zhì)疑。水產(chǎn)來(lái)源的明膠不僅具有更好的安全性，還可迎合部分地區(qū)的宗教需求，有利于水產(chǎn)加工副產(chǎn)物(魚皮和魚骨)的高值化利用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

目前水產(chǎn)來(lái)源明膠原料主要是魚皮[1-3］，而使用魚骨提取明膠的研究還較少。太平洋真鱈(Gadus macrocephalus)是重要的商業(yè)捕撈魚種，目前我國(guó)對(duì)真鱈的加工主要集中在利用其魚肉進(jìn)行鱈魚魚片的生產(chǎn)，產(chǎn)生的廢棄物如皮、骨等盡管具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但僅有一部分用于小食品和低值魚粉的生產(chǎn)。因此，從水產(chǎn)加工副產(chǎn)物魚骨中提取明膠，既能增加產(chǎn)品的附加值，同時(shí)可以擴(kuò)大明膠的原料選擇，減少資源的浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)著重研究從太平洋真鱈魚骨中提取明膠的最佳工藝及明膠的主要性質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)魚骨明膠的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

太平洋真鱈(Gadus macrocephalus)魚骨取自青島福生食品有限公司，真鱈來(lái)源于白令海。原料獲取后去除雜質(zhì)，冷藏于-18℃冰箱中備用。

乙二胺四乙酸二鈉、HCl、氯胺T、對(duì)二甲氨基甲醛等試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司出品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋(HHS-Ni)，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠制造;冷凍干燥機(jī)(Alpha 1-4 LD型)，德國(guó)CHRIST公司制造;紫外分光光度計(jì)(UV-2102PC型)，尤尼柯(上海)儀器有限公司制造;傅立葉紅外光譜儀(Nicoletnexos型)，美國(guó)Nicolet公司制造;掃描電子顯微鏡(JSM-840)，日本JEOL公司出品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本成分測(cè)定

水分測(cè)定:恒溫干燥法(GB/T 5009.3-2003);蛋白質(zhì)測(cè)定:凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2003);脂肪測(cè)定:乙醚抽提法(GB/T 5009.6-2003);灰分的測(cè)定:灰化法(GB/T 5009.4-2003);羥脯氨酸測(cè)定:依照ISO3496:1978(E)[4］方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 魚骨明膠提取

1.2.2.1 明膠提取的工藝流程

冷凍魚骨→清洗，去雜質(zhì)→NaOH溶液處理→水洗至中性→EDTA溶液處理→鹽酸處理→水洗至中性→勻漿→提膠→離心→真空濃縮→冷凍干燥→成品明膠

1.2.2.2 明膠提取率

式中:T，明膠提取率，%;A，提取明膠中的羥脯氨酸含量，g;B，原料中羥脯氨酸的含量，g。

1.2.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

太平洋真鱈魚骨明膠單因素實(shí)驗(yàn)的基本條件設(shè)定為:HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，酸處理時(shí)間為12 h，提取溫度為50℃，提取時(shí)間為6 h，提膠料液比為1∶10。改變其中一個(gè)條件，固定其他條件以分析HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸處理時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間及提膠料液比對(duì)明膠得率的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以明膠得率為指標(biāo)，對(duì)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酸處理時(shí)間、提取溫度和提取時(shí)間4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9(34)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，優(yōu)化提取工藝。

1.2.3 明膠的紫外光譜掃描

將提取得到的明膠樣品溶解于0.5 mol/L醋酸溶液中，配制成1 mg/mL的明膠溶液，使用UV-2550紫外分光光度計(jì)在200～400 nm近紫外光區(qū)以120 nm/min的速度進(jìn)行掃描。

1.2.4 傅立葉紅外光譜(FTIR)分析

在干燥條件下，將適量樣品和KBr在瑪瑙研缽中充分研磨混勻。取樣品手動(dòng)壓片，將樣品放入樣品室，使用Nicolet-200SXV傅立葉紅外光譜儀對(duì)樣品在4000～500 cm-1區(qū)間掃描，分辨率設(shè)置為2 cm-1。

1.2.5 掃描電鏡觀察

取冷凍干燥樣品固定后真空噴金處理，加速電壓為20 kV，以JSM-840型掃描電子顯微鏡觀察樣品的顯微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱈魚骨基本成分測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的真鱈魚骨基本組成成分見表1。

表1 鱈魚骨基本組成成分

該魚骨中粗蛋白含量17.3%，灰分14.7%，水分含量64.2%，脂肪含量1.2%，羥脯氨酸含量1.2%。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸的濃度可以得到膠原蛋白的大致含量。一般對(duì)水生動(dòng)物換算系數(shù)通常采用11.1[5］，得出鱈魚骨中的膠原蛋白含量約為13.3%，約占總蛋白的77%。因此，魚骨可作為一種較好的明膠提取原料。

2.2 酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)明膠得率的影響

經(jīng)EDTA溶液脫鈣處理后，魚骨色澤潔白，感官評(píng)價(jià)較軟。直接對(duì)脫鈣后的魚骨進(jìn)行熱水抽提明膠得率極低，這是因?yàn)槊撯}魚骨組織結(jié)構(gòu)緊密，單純的熱處理無(wú)法有效破壞組織中膠原蛋白的氫鍵和共價(jià)鍵，膠原難以轉(zhuǎn)化成明膠被提取出來(lái)。因此，首先需用酸溶液對(duì)原料進(jìn)行溶脹處理。酸處理可以打開膠原端肽區(qū)的交聯(lián)、膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的酰胺鍵以及膠原分子內(nèi)和分子間的氫鍵、共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵，從而使原料溶脹進(jìn)而提高熱水抽提的提取率[6］。

圖1 酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)明膠提取率的影響

實(shí)驗(yàn)分析了酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～5%內(nèi)對(duì)明膠提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，HCl濃度在小于2%時(shí)，明膠得率增加緩慢。這是因?yàn)樵谠现?，膠原在分子內(nèi)、分子間以及端肽區(qū)具有大量由氫鍵、共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵所形成的交聯(lián)[6］，低濃度的酸溶液無(wú)法有效打開這些交聯(lián);當(dāng)濃度大于2%時(shí)，膠原分子內(nèi)和分子間的離子交聯(lián)和氫鍵交聯(lián)被充分打開，熱水處理時(shí)水分子能輕易進(jìn)入膠原分子鏈的間隙，有效促進(jìn)了熱力對(duì)氫鍵和非共價(jià)鍵的斷裂，從而提高顯著明膠得率。在酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)明膠得率達(dá)到高值;但當(dāng)酸濃度繼續(xù)增加時(shí)明膠的提取率會(huì)有所下降，這可能是因?yàn)闈舛冗^(guò)大反而會(huì)致使酸溶性的膠原在處理過(guò)程中溶解到酸溶液中或被直接酸解。因此酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在3.5%左右較為合適。

2.3 酸處理時(shí)間對(duì)明膠得率的影響

實(shí)驗(yàn)分析了4～20 h內(nèi)不同酸處理時(shí)間對(duì)明膠提取率的影響。從圖2中可以看出，酸處理時(shí)間在16 h以內(nèi)時(shí)，明膠的得率一直在顯著上升。這是因?yàn)槊撯}后的原料雖然變軟，但結(jié)構(gòu)仍較為致密，酸溶液需要一定的時(shí)間對(duì)其進(jìn)行溶脹;當(dāng)酸處理時(shí)間達(dá)到16h時(shí)，酸溶液對(duì)膠原分子的溶脹較為充分，明膠提取率達(dá)到最高;但當(dāng)酸處理時(shí)間進(jìn)一步提高時(shí)，得率卻再無(wú)顯著變化。繼續(xù)進(jìn)行酸處理，酸對(duì)膠原的溶脹作用已經(jīng)結(jié)束，而膠原分子可能會(huì)由于過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的酸處理而被部分降解成分子質(zhì)量更小的肽鏈，溶解在酸溶液中進(jìn)而造成膠原的損失。因此，酸處理的理想時(shí)間為16 h為宜。

圖2 酸處理時(shí)間對(duì)明膠提取率的影響

2.4 提取溫度對(duì)明膠得率的影響

實(shí)驗(yàn)分析了在40～80℃內(nèi)提取溫度對(duì)明膠提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。當(dāng)原料經(jīng)充分溶脹后，加熱可以有效斷裂膠原分子端肽區(qū)域及三螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域的次級(jí)鍵，使膠原溶出轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z。由圖3可以看出，明膠的得率隨溫度的升高而升高，溫度達(dá)到70℃時(shí)明膠提取率高達(dá)94.3%;當(dāng)提取溫度進(jìn)一步升高時(shí)，明膠得率增加不顯著。提高提取溫度可大大縮減提取時(shí)間并提高明膠得率，但相應(yīng)會(huì)加速明膠的次級(jí)水解，使明膠的黏度和凝膠強(qiáng)度下降[7］。由此可見，魚骨明膠提取溫度為70℃較為合適。

圖3 提取溫度對(duì)明膠提取率的影響

2.5 提取時(shí)間對(duì)明膠得率的影響

圖4 表明，明膠提取率隨著提取時(shí)間的增加而明顯提高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到8 h時(shí)明膠得率達(dá)到57.8%。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，明膠得率變化不大。熱水抽提時(shí)間過(guò)短，明膠無(wú)法充分提取出來(lái)，得率太低;時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)使明膠過(guò)度水解[8］，降低明膠的理化性質(zhì)。因此，魚骨明膠較合適的提取時(shí)間為8 h為宜。

2.6 提膠料液比對(duì)明膠得率的影響

料液比是影響明膠提取率的因素之一，合適的料液比可以使原料中的明膠得到充分提取。由圖5可知，明膠得率在料液比1∶6時(shí)達(dá)到最高。料液比較低時(shí)，由于體系內(nèi)溶劑含量少，不利于原料在溶劑中得到充分震蕩，得率較低。當(dāng)料液比超過(guò)1∶6時(shí)，其提取效率增加幅度不大，也會(huì)增加后續(xù)離心、濃縮等工藝步驟的工作量。因此，料液比選為1∶6比較合適。

圖4 提取時(shí)間對(duì)明膠提取率的影響

圖5 提膠料液比對(duì)明膠提取率的影響

2.7 魚骨明膠最優(yōu)提取條件的選擇

表2 魚骨明膠提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在提取魚骨明膠時(shí)，既要盡可能提高產(chǎn)品得率，同時(shí)還要降低提取成本。采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表2。由極差R值可以看出，各因素對(duì)明膠得率的影響大小為提取溫度＞酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酸處理時(shí)間＞提取時(shí)間。因此，提取溫度對(duì)明膠得率的影響最為顯著。明膠得率極差分析最佳組合為A2B3C3D3，即酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，酸處理時(shí)間18 h，提取溫度70℃，提取時(shí)間8 h。在此優(yōu)化條件下，明膠提取率為98.02%。

2.8 魚骨明膠部分性質(zhì)研究

2.8.1 魚骨明膠基本成分測(cè)定

真鱈魚骨在最佳工藝條件下通過(guò)離心、濃縮、冷凍干燥后可以得到純度較高、色澤潔白、無(wú)異味的魚骨明膠。由表3可見，魚骨明膠蛋白質(zhì)含量大約94.1%，羥脯氨酸含量約7.5%，明膠純度達(dá)到90.4%。

表3 魚骨明膠基本組成成分

2.8.2 紫外光譜分析

蛋白質(zhì)分子中含有能吸收一定紫外波長(zhǎng)光的紫外生色基團(tuán)，例如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸在280 nm處有較強(qiáng)的紫外吸收，各種紫外生色基團(tuán)的加和使得蛋白質(zhì)溶液在紫外區(qū)存在一定的吸收[9］。由圖6可見，魚骨明膠的最大吸收波長(zhǎng)約在235 nm處，這是明膠的特征吸收峰，主要是電子的N→л*和N→σ*躍遷所產(chǎn)生。魚骨明膠在280 nm處吸收較少，說(shuō)明樣品只含有少量芳香族氨基酸，可以初步判斷所提取的明膠具有較高的純度。

2.8.3 傅立葉紅外光譜(FTIR)分析

傅立葉紅外光譜可用來(lái)研究膠原蛋白和明膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。在紅外光譜中可以表示蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的區(qū)域主要是酰胺A[10］，酰胺I(1636～1661 cm-1)，酰胺II(1549～1558 cm-1)[11］和酰胺III(1200～1300cm-1)[12］。其中，酰胺I帶是蛋白質(zhì)多肽骨架CO伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的最有效區(qū)域[13］。由圖7可見，與酸法[14］提取的未變性酸溶性膠原蛋白(B)相比，熱水抽提明膠(A)的酰胺A吸收峰變寬，而酰胺I(1648.46 cm-1)、II(1540.64 cm-1)、III(1237.83 cm-1)峰值強(qiáng)度明顯減少。這些變化表示，明膠分子失去了三螺旋結(jié)構(gòu)而轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)序狀態(tài)[12］。

圖6 魚骨明膠的紫外吸收光譜

圖7 骨明膠的傅立葉紅外(FTIR)光譜圖

2.8.4 掃描電鏡觀察

圖8 魚骨明膠的掃描電鏡(SEM)圖

如圖8所示，在掃描電鏡下魚骨明膠具有細(xì)小連續(xù)孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這些孔徑的大小與制備明膠過(guò)程中水分含量的多少有關(guān)。這種有序的多孔海綿狀結(jié)構(gòu)可以有效容納固體及液體微粒。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)孔徑的大小，明膠能夠作為藥物的新型載體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的開發(fā)和應(yīng)用[15］。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)確定了真鱈魚骨提取明膠的最佳條件:HCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，酸處理時(shí)間18 h，提取溫度70℃，提取時(shí)間8 h，明膠提取率可達(dá)98.02%。經(jīng)過(guò)離心、濃縮、干燥后得到白色、無(wú)異味的魚骨明膠，其純度達(dá)到90.4%。經(jīng)紫外光譜掃描，明膠在235 nm處有最大吸收，在280 nm處吸收較少。紅外光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)明膠失去三螺旋結(jié)構(gòu)。在掃描電鏡觀察下明膠具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

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ABSTRACTAquatic gelatin was prepared from the bone of Pacific cod.The influences of different extraction parameters，including concentration of hydrochloric acid，acid soaking time，extraction temperature and time on the extraction rate of bone gelatin were investigated.On the base of single-factor experiment，the optimum parameters of extraction for bone gelatin were obtained by orthogonal experiment as follows:the concentration of hydrochloric acid 4%，acid soaking time 18h，the extraction temperature 70℃and time 8h，the yield was 98.02%.Gelatin exhibited the maximum absorbance at 235nm.FTIR spectra showed the significant loss of molecular order of triple helix.The gelatin displayed a polyporous network under SEM.

Key wordscod bone，gelatin，extraction，yield

Study on the Extraction and Property of Gelatin from Pacific Cod Bone

Wang Shan-shan，Shan Yin-yin，Li Zhi-hao，Qiao Ruo-jin，Li Ba-fang
(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

博士研究生(李八方教授為通訊作者，Email:bfli@ouc.edu.cn。)。

*國(guó)家自然科學(xué)基金(30871943)狹鱈魚皮膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)與物理及其耦合性的研究

2011-10-10，改回日期:2011-12-12