李虹，馮雷，劉毅，宋國(guó)勇，陳輝，張露

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

2(北京大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與保健食品評(píng)價(jià)中心，北京，100083)

納豆溶栓效應(yīng)的研究

李虹1，馮雷1，劉毅2，宋國(guó)勇1，陳輝1，張露1

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

2(北京大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與保健食品評(píng)價(jià)中心，北京，100083)

探討了納豆產(chǎn)品的溶栓效應(yīng)。采用凍干納豆粉灌胃，在復(fù)制的大鼠血栓模型上，通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察血壓的變化，比較血栓的大小以及檢測(cè)纖溶酶原激活物質(zhì)抑制劑(PAI)、組織型纖溶酶原激活物(tPA)活性等指標(biāo)，觀察凍干納豆粉對(duì)血栓的作用及其機(jī)理。將SD大鼠隨機(jī)分5組(N=40)，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度的凍干納豆灌胃，同等劑量的蚓激酶設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照，用Powerlab/4s描記股動(dòng)脈血壓，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿中PAI-I及tPA活性。凍干納豆組與正常對(duì)照組、單純血栓組相比，復(fù)制血栓前血壓無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，血栓復(fù)制40min后，凍干納豆組、陽(yáng)性對(duì)照組與單純血栓組血壓相比有顯著性差異(P＜0.001);凍干納豆處理的動(dòng)物與單純血栓組動(dòng)物比較，其血栓的濕重、干重顯著性降低(P＜0.001);凍干納豆組、陽(yáng)性對(duì)照組血漿中tPA活性升高，PAI/tPA比值與對(duì)照相比顯著降低(P＜0.001)。凍干納豆對(duì)動(dòng)脈血栓的形成有抑制作用。

納豆，冷凍干燥，納豆激酶，溶栓效應(yīng)

血栓的形成是引起心肌梗死、腦卒中等心血管疾病死亡的重要因素之一，控制血栓的形成、增強(qiáng)纖溶活性對(duì)心腦血管疾病防治具有重要意義。從膳食成分中發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)抗栓和溶栓物質(zhì)，具有廣泛的臨床實(shí)用價(jià)值[1］。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，日本人心腦血管疾病的發(fā)病率明顯低于其它民族，這與其傳統(tǒng)飲食習(xí)慣有關(guān)。納豆(Natto)是在日本備受關(guān)注的一類營(yíng)養(yǎng)食品，它是以大豆為原料，煮熟之后加入納豆菌(枯草桿菌Bacillus subtilis)發(fā)酵制成的一種傳統(tǒng)食品。據(jù)記載，納豆起源于中國(guó)，公元753年中國(guó)唐代高僧鑒真東渡日本傳經(jīng)時(shí)，攜帶了“甜豉”到日本，這種甜豉應(yīng)該就是納豆的前身，至今納豆已經(jīng)有近2000年的食用歷史。納豆類似于我國(guó)的豆豉，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高。近年來(lái)，人們對(duì)它廣泛的生物學(xué)作用及其保健功能極為重視。已有研究證明，納豆對(duì)心腦血管疾病、骨質(zhì)疏松、便秘等有預(yù)防和治療效果。1987年Sumi等人發(fā)現(xiàn)，納豆在體內(nèi)外均具有溶栓作用[2-3］，但抗栓效應(yīng)機(jī)理還未完全闡明。本研究采用凍干納豆灌胃，在復(fù)制血栓的模型上，觀察其對(duì)血栓形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

正常雄性S-D大鼠40只，體重200～250 g左右，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心提供;凍干納豆，中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院;蚓激酶，購(gòu)于北醫(yī)三院;tPA、PAI試劑盒，購(gòu)自上海實(shí)業(yè)醫(yī)大生物技術(shù)有限公司;其它試劑為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠血栓模型制作及實(shí)驗(yàn)分組

參照Kurz等[4］方法復(fù)制動(dòng)脈血栓形成模型。大鼠禁食8 h，自由飲水，用20%烏拉坦腹腔注射(5 mL/kg)麻醉，股動(dòng)脈插管經(jīng)換能器在生理多導(dǎo)儀上監(jiān)測(cè)股動(dòng)脈血壓。腹正中切口，游離約2 cm長(zhǎng)的膈下腹主動(dòng)脈段，用30%FeCl3浸漬過(guò)的濾紙(1 cm×1 cm)仔細(xì)包裹腹主動(dòng)脈(小心保護(hù)周圍組織)，30 min后取除濾紙條，10 min后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組:⑴單純血栓組:操作見(jiàn)上述;⑵低劑量?jī)龈杉{豆組:預(yù)先用凍干納豆30 mg/(kg·次)，灌胃，連續(xù)2天，血栓制備同第1組;⑶高劑量?jī)龈杉{豆組:方法同第2組，但灌胃納豆素劑量為300 mg/(kg·次);⑷蚓激酶組:方法同第2組，但用蚓激酶劑量為30 mg/(kg·次);⑸對(duì)照組:操作同第1組，但所覆蓋腹主動(dòng)脈的濾紙片為生理鹽水浸泡。

1.2.2 監(jiān)測(cè)指標(biāo)

⑴血液動(dòng)力學(xué)、形態(tài)學(xué)檢測(cè)及蛋白定量

觀察血壓的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)從血栓上端腹主動(dòng)脈或腎靜脈抽血(股動(dòng)脈放血)3～5 mL，離心后取血清作生化檢測(cè)。結(jié)扎濾紙條覆蓋部位上下端動(dòng)脈(至少距1 cm以上)，從腹主動(dòng)脈濾紙覆蓋部位準(zhǔn)確取局部血栓段1 cm，放入蓋玻片上稱其濕重，然后在烤箱內(nèi)(90℃過(guò)夜)烤干稱其干重，并將其溶于2 mL堿性NaHCO3溶液中(在0.1mol/L NaOH溶液中含2%Na2CO3)，沸水浴3min，用考馬斯亮藍(lán)法蛋白定量，計(jì)算血栓的蛋白含量(mg pro/g DW)。

⑵生化指標(biāo)檢測(cè)

PAI-1、tPA(上海實(shí)業(yè)-醫(yī)大生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))測(cè)定:取血2 mL置于含3.8%枸櫞酸鈉200μL的試管中混勻，2500 r/min離心15min，血漿于-20℃保存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定，PAI-1的單位以UI/mL表示，tPA的單位以UI/mL表示或用發(fā)色底物法測(cè)其活性[5］，PAI-1用發(fā)色底物法測(cè)其活性。按試劑盒說(shuō)明制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)標(biāo)本稀釋后加入平底酶標(biāo)板，然后按說(shuō)明加入發(fā)色底物、纖溶酶原和加速劑，37℃水浴180 min后終止反應(yīng)，應(yīng)用BIO-RAD型酶標(biāo)儀在405nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算PAI-1活性。PAI-1的正常參考值為(5.94±2.47)AU/mL。tPA活性測(cè)定用發(fā)色底物法，按試劑盒說(shuō)明制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)標(biāo)本稀釋后加入平底酶標(biāo)板，然后按說(shuō)明加入發(fā)色底物、纖溶酶和加速劑，37℃水浴180 min后終止反應(yīng)，應(yīng)用BIO-RAD型酶標(biāo)儀在405 nm，波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算tPA活性。血漿tPA抗原測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法原理測(cè)定血漿tPA抗原。按試劑盒說(shuō)明，將tPA標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確復(fù)溶、倍比稀釋，得濃度為60、30、15、7.5、3.75 ng/mL 五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn):將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血漿100μL加入抗體包被酶標(biāo)板各孔中，37℃孵育150 min后棄去反應(yīng)空內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，拍干，再加入酶標(biāo)抗體100μL，37℃孵育60 min，洗滌3次后拍干，然后每孔加底物100μL，37℃孵育15～20 min后每孔加終止液50μl，在BIORAD型酶標(biāo)儀上492 nm處測(cè)定各孔的OD值，以O(shè)D492對(duì)tPA標(biāo)準(zhǔn)品濃度在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作標(biāo)準(zhǔn)曲線，待測(cè)樣品tPA抗原水平(ng/mL)可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出tPA抗原的正常參考值為1.0～12.8ng/mL。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用one-way ANOVA作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用Student-Newman-Keuls(SNK)方法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干納豆對(duì)血栓形成的影響

本實(shí)驗(yàn)各組血清中tPA、PAI、PGI2、TAX2檢測(cè)結(jié)果及血壓、血栓形成情況見(jiàn)表1。

由表1可以看出，與單純血栓組相比較，治療各組血栓濕重、血栓干重和血栓蛋白含量均明顯降低(P＜0.01)，高劑量?jī)龈杉{豆組與蚓激酶組血栓濕重略低于低劑量?jī)龈杉{豆組(P＜0.01)，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組血栓濕重、干重、蛋白定量

2.2 凍干納豆對(duì)血壓的影響

由表2看出，血栓組動(dòng)物股動(dòng)脈血壓在血栓復(fù)制后較血栓復(fù)制前降低60%(P＜0.01)，表明股動(dòng)脈嚴(yán)重血栓栓塞，藥物治療各組血栓制作后股動(dòng)脈血壓降低幅度較單純血栓組明顯輕微(P＜0.01)，而接近對(duì)照組血壓水平(P＞0.05)，各治療組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在復(fù)制前后股動(dòng)脈血壓變化

2.3 凍干納豆對(duì)大鼠血漿中tPA、PAI活性的影響及PAI/tPA比值的變化

由表3可以看出，與對(duì)照組相比較，血栓形成(單純血栓組)既激活 PAI也激活 tPA(P均為0.01)，PAI/tPA顯著減少(P＜0.01)，表明內(nèi)源泉性纖溶系統(tǒng)激活。治療各組PAI水平明顯低于，而tPA水平顯著高于單純血栓組(P均小于0.01)，PAI/tPA的比值亦明顯降低(P＜0.01)，高劑量納豆組略高于低劑量納豆組(P＜0.01)，與蚓激酶組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表3 凍干納豆對(duì)大鼠tPA、PAI的水平的影響

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)論與分析

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，凍干納豆組與正常對(duì)照組、單純血栓組相比、復(fù)制血栓前血壓無(wú)顯著性差異，血栓復(fù)制40 min后，凍干納豆組、陽(yáng)性對(duì)照組與單純血栓組血壓相比有顯著性差異;凍干納豆處理的動(dòng)物與單純血栓組動(dòng)物比較，其血栓的濕重、干重顯著性降低;凍干納豆組、陽(yáng)性對(duì)照組血漿中tPA活性升高，PAI/tPA比值與對(duì)照相比顯著降低。

tPA為體內(nèi)重要的纖溶激活劑。在血栓形成的過(guò)程中，有大量的纖溶酶原(plasminogen，PLG)被吸收入血栓中，形成纖溶酶原/纖維蛋白復(fù)合物。tPA主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放的絲氨酸蛋白酶，能選擇性地作用于纖溶酶原/纖維蛋白復(fù)合物，使PLG轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasmin，PL)，PL能將纖維蛋白(fibrin，F(xiàn)b)裂解成纖維蛋白降解產(chǎn)物，從而溶解血栓。研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)灌胃凍干納豆粉后，血液中的tPA含量升高，大鼠血栓重量減少，說(shuō)明纖溶系統(tǒng)功能加強(qiáng)，可以降解血栓，因此，納豆凍干粉中含有促進(jìn)tPA產(chǎn)生的酶-納豆激酶。體內(nèi)同時(shí)存在著PAI，在所有的PAI中，以PAI-1最為重要。正常情況下血漿tPA和PAI-1處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[6］。全血 PAI-1的3/4儲(chǔ)存在血小板中，當(dāng)血小板活化釋放時(shí)，PAI-1被釋放到血液中，抑制tPA的活性。血漿PAI-1水平升高與心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化、血管再狹窄等心腦血管病變的形成關(guān)系密切。本研究結(jié)果PAI-1/tPA比顯著降低，也表明對(duì)大鼠血栓的降解有促進(jìn)作用。因此，凍干納豆中存在特異性的酶-納豆激酶對(duì)動(dòng)脈血栓的形成有抑制作用。

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ABSTRACTThis Paper evaluates the thrombolytic effect of freeze-dried Natto products(referred to as:freeze-dried natto)by dynamic measuring the change of blood pressure，the size of thrombus and the activity of plasminogen activator inhibitor substances(PAI)or tissue plasminogen activator(tPA)in the thrombus mode.S-D rats were divided into five groups randomly(N=40)，fed with different concentrations of freeze-dried natto or the same dose of Lumbrokinase respectively.The femoral artery pressures were traced by Powerlab/4s.The PAI and tPA activity were detected by ELISA.The femoral artery pressure of rats fed with freeze-dried natto，fed with Lumbrokinase and fed with normal chow were all at the same level(P ＞0.05).The decrease level of femoral artery pressure of rats fed with freeze-dried natto or Lumbrokinase were lower than the rats fed with normal chow since after the thrombus forming for 40 min(P ＜0.001).The wet weight or dry weight of the thrombus were significantly lower on the rats fed with freezedried natto than that on the rats fed with normal chow(P ＜0.001).Compared with the rats fed with normal chow，the tPA activity increased as well as the PAI/tPA ratio decreased obviously in plasma of the rats fed with freeze-dried natto or Lumbrokinase(P ＜0.001).The freeze-dried natto can inhibit the formation of arterial thrombosis.

Key wordsnatto，freeze-dry，nattokinase，thrombolytic effect

The Study on Thrombolytic Effect of Nattokinase

Li Hong1，F(xiàn)eng Lei1，Song Guo-yong1，Chen Hui1，Zhang Lu1，Liu Yi2
1(China National Research Institute of Food and Fermentation，Beijing 100027，China)
2(Nutrition and Health Food Evaluation Center of Peking University，Beijing 100083，China)

學(xué)士，高級(jí)工程師。

2012-02-16，改回日期:2012-03-06