陳龍 常云霞 葛紅蓮

摘要：采用土培的方法，研究了污水脅迫對(duì)小麥幼苗葉片和根ＤＮＡ含量及ＤＮＡ增色效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，低濃度污水處理能提高葉片及根ＤＮＡ含量，ＤＮＡ增色效應(yīng)略有下降；高濃度污水使小麥葉片及根中ＤＮＡ的含量減少、ＤＮＡ增色效應(yīng)顯著降低。

關(guān)鍵詞：污水脅迫；小麥幼苗；ＤＮＡ含量；ＤＮＡ增色效應(yīng)

中圖分類號(hào)：Ｓ５１２．１；Ｑ９４５．７８文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）16－3440-02

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｅｗａｇｅ Ｗａｔｅｒ Sｔｒｅｓｓ ｏｎ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ ｏｆ Ｗｈｅａｔ Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ

ＣＨＥＮ Ｌｏｎｇ，ＣＨＡＮＧ Ｙｕｎ－ｘｉａ，ＧＥ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｚｈｏｕｋｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈｏｕｋｏｕ ４６６００１，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｗａｇｅ ｗａｔｅｒ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ was investigated ｗｉｔｈ ｓｏｉｌ ｐｏｔ cultivation． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｗａｇｅ ｗａｔｅｒ ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ， ａｎｄ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｌｏｗｅｒｅｄ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ； ｗｈｉｌｅ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ decreased ｔｈｅ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＤＮＡ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｅｗａｇｅ ｗａｔｅｒ ｓｔｒｅｓｓ； ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ； ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ； ＤＮＡ ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ

我國淡水資源匱乏，分布不均，污染也較為嚴(yán)重，污水的資源化問題已經(jīng)受到關(guān)注和重視，國內(nèi)外對(duì)于污水灌溉的研究已積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)［１］。污水灌溉不僅提供了灌溉所需的水資源，緩解了干旱缺水地區(qū)農(nóng)業(yè)用水的供需矛盾，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且還可增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，但也可能會(huì)因攜帶有害物質(zhì)而引起土壤、作物中重金屬積累和有毒有機(jī)物含量超標(biāo)，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)變劣，使作物生長(zhǎng)發(fā)育受阻甚至死亡等不良后果［２，３］。小麥?zhǔn)俏覈狈礁珊蛋敫珊档貐^(qū)主要的糧食作物，是污水灌溉的主要對(duì)象之一。關(guān)于污水灌溉對(duì)植物的傷害效應(yīng)研究較多，但研究主要集中于植物生長(zhǎng)發(fā)育的外在表現(xiàn)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、過氧化脅迫、光合系統(tǒng)等方面［４，５］，有關(guān)污水灌溉對(duì)作物ＤＮＡ損傷效應(yīng)綜合影響的研究還未見報(bào)道。試驗(yàn)采用土培的方法，研究沙潁河污水對(duì)小麥幼苗葉片和根系ＤＮＡ提取量及增色效應(yīng)的影響，以期為污水灌溉、污水改良和耐污小麥品種的培育提供理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

以河南栽培的小麥品種周麥１８（以Ｚ１８表示）和花培５號(hào)（以Ｈ５表示）為材料，種子由河南省周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。污水取自周口市川匯區(qū)內(nèi)的沙潁河與賈魯河交匯處的河水。原液即污水，清水為自來水，土壤為麥田土。

１．２方法

１．２．１試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取子粒飽滿、大小均勻的小麥種子，洗凈后分別放入去離子水中浸泡、催芽１ ｄ，再均勻種植于土培盤中，用不同的水澆灌培養(yǎng)。分別用Ｖ（清水）∶Ｖ（污水）為１∶０（對(duì)照，Ａ０）、４∶１（Ａ１）、３∶２（Ａ２）、２∶３（Ａ３）、１∶４（Ａ４）、０∶１（Ａ５）培養(yǎng)小麥。隔天澆水1次，澆透為止，所有處理均設(shè)３次重復(fù)。幼苗培養(yǎng)條件為：白天溫度（２５±０．５）℃，每日光照１２ ｈ，夜晚溫度（１８±０．５） ℃。培養(yǎng)１５ ｄ后取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每種處理每個(gè)指標(biāo)均對(duì)樣品進(jìn)行３次重復(fù)測(cè)定，取平均值。

１．２．２污水理化性質(zhì)的測(cè)定采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定化學(xué)需氧量（ＣＯＤＣｒ），以過濾烘干稱重法測(cè)定懸浮物（ＳＳ），全磷（ＴＰ）測(cè)定采用鉬藍(lán)比色法，氨態(tài)氮含量測(cè)定采用常規(guī)測(cè)定方法［６］；鉛、鎘的測(cè)定采用原子吸收分光光度法［７］；汞的測(cè)定參照文獻(xiàn)［８］的方法；ｐＨ采用酸度計(jì)法測(cè)定。污水理化性質(zhì)的測(cè)定結(jié)果見表1。

１．２．３ＤＮＡ提取及增色效應(yīng)的測(cè)定ＤＮＡ提取與含量測(cè)定：ＤＮＡ提取采用ＣＴＡＢ法［９］。將提取的ＤＮＡ沉淀于１.0 ｍＬ ＴＥ中，－２０ ℃保存?zhèn)溆?。取葉片和根ＤＮＡ樣品各１００μＬ，用ＴＥ稀釋到２．５ ｍＬ，在紫外可見分光光度計(jì)（日本島津，Ｖ－５３０）上測(cè)定Ａ２６０ nm和Ａ２８０ nm，以Ａ２６０ nm估算ＤＮＡ得率，以Ａ２６０ nm／Ａ２８０ nm判斷ＤＮＡ樣品的純度。

ＤＮＡ增色效應(yīng)的測(cè)定：取各處理葉片和根ＤＮＡ樣品各２份，每份１００ μＬ，溶于２．５ ｍＬ、０．０８ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣl溶液中，一份在７０℃水浴中加熱，另一份置于室溫（２５ ℃）下，３０ ｍｉｎ后分別測(cè)定Ａ２６０ nm，以［（Ａ２６０ nm、７０ ℃－Ａ２６０ nm、２５ ℃）／Ａ２６０ nm、２５ ℃］×１００％作為ＤＮＡ增色效應(yīng)指標(biāo)。

２結(jié)果與分析

２．１污水對(duì)小麥幼苗葉片和根ＤＮＡ含量的影響

由表２可知，污水對(duì)小麥幼苗葉片和根ＤＮＡ含量（以提取量表示）的影響情況相似，在較低濃度的污染狀況下，小麥幼苗葉片和根ＤＮＡ提取量均有所升高，但污染程度較高時(shí)使ＤＮＡ提取量降低。在處理Ａ１時(shí)小麥幼苗葉片的ＤＮＡ提取量達(dá)到最高值，Ｈ５和Ｚ１８分別是對(duì)照（Ａ０）的１１８.0％和１２２．１％，隨著污染程度加重ＤＮＡ提取量開始下降，在處理Ａ５時(shí)ＤＮＡ提取量最低，Ｈ５和Ｚ１８分別是對(duì)照的５９．３％和７１．０％；小麥幼苗根的ＤＮＡ提取量在處理Ａ２時(shí)達(dá)到最高值，Ｈ５和Ｚ１８分別是對(duì)照的１４１．５％和１４３．９％，隨著污染程度加重ＤＮＡ的提取量逐漸下降，在處理Ａ５時(shí)ＤＮＡ含量最低，Ｈ５和Ｚ１８分別是對(duì)照的６０．６％和７８．９％。通過比較還可以看出，根細(xì)胞中ＤＮＡ含量比葉片中提取量低，受污染影響時(shí)ＤＮＡ提取量的變化幅度也較葉片小，表明葉片和根對(duì)于污染脅迫反應(yīng)的敏感程度有一定差異。

２．２污水對(duì)小麥幼苗葉片和根ＤＮＡ增色效應(yīng)影響

污水對(duì)兩個(gè)小麥品種幼苗葉片ＤＮＡ增色效應(yīng)的影響趨勢(shì)相似，在污染脅迫較輕（Ａ１～Ａ３）時(shí)，ＤＮＡ增色效應(yīng)變化幅度很小，基本維持在對(duì)照（Ａ０）的水平，嚴(yán)重污染脅迫（Ａ４～Ａ５）時(shí)，ＤＮＡ增色效應(yīng)呈現(xiàn)出明顯的下降現(xiàn)象，此時(shí)兩個(gè)小麥品種幼苗葉片的ＤＮＡ增色效應(yīng)均為0（圖1）。污水對(duì)兩個(gè)小麥品種幼苗根ＤＮＡ增色效應(yīng)的影響趨勢(shì)較為類似，在污染脅迫較輕（Ａ１～Ａ２）時(shí)，ＤＮＡ增色效應(yīng)基本維持在對(duì)照（Ａ０）的水平；當(dāng)Ａ３處理時(shí)，ＤＮＡ增色效應(yīng)呈現(xiàn)出明顯的下降現(xiàn)象，此時(shí)Ｈ５的ＤＮＡ增色效應(yīng)為0，Ｚ１８的ＤＮＡ增色效應(yīng)明顯下降，污染脅迫進(jìn)一步加重（Ａ４～Ａ５）時(shí)的ＤＮＡ增色效應(yīng)均為0（圖２）。

３小結(jié)與討論

用污水處理小麥幼苗時(shí)，在低濃度時(shí)可以使ＤＮＡ含量升高，這可能是污水中含有大量Ｎ、Ｐ等元素，可促進(jìn)小麥ＤＮＡ合成。高濃度的污水不僅降低了小麥幼苗葉片的ＤＮＡ提取量，也使根ＤＮＡ提取量明顯降低。重金屬污染會(huì)導(dǎo)致水稻和小麥葉片ＤＮＡ提取量降低，若在提取時(shí)加入胰蛋白酶，ＤＮＡ提取量會(huì)增加，推測(cè)重金屬有促進(jìn)ＤＮＡ和蛋白質(zhì)交聯(lián)的效應(yīng)。小麥幼苗葉片和根ＤＮＡ提取量降低的效應(yīng)也與污染物促進(jìn)ＤＮＡ和蛋白質(zhì)交聯(lián)有關(guān)，也可能與其導(dǎo)致ＤＮＡ降解加速或ＤＮＡ合成下降等有關(guān)［１０］。

Ｋｏｃｈ等［１１］報(bào)道，增色效應(yīng)可反映ＤＮＡ的解鏈程度，而ＤＮＡ解鏈程度與其鏈長(zhǎng)及鏈間交聯(lián)程度等有關(guān)，ＤＮＡ斷裂會(huì)使鏈長(zhǎng)變短，因而增色效應(yīng)提高，ＤＮＡ鏈間交聯(lián)則使增色效應(yīng)下降，因此可以用增色效應(yīng)結(jié)果判斷ＤＮＡ是否斷裂以及是否發(fā)生了鏈間交聯(lián)等損傷效應(yīng)。研究說明，污水對(duì)小麥幼苗葉片ＤＮＡ和根ＤＮＡ均具有一定的損傷，特別是根對(duì)其較為敏感。在高濃度的污染脅迫下兩個(gè)小麥品種幼苗葉片和根ＤＮＡ增色效應(yīng)均明顯降低，說明污水處理導(dǎo)致了兩個(gè)品種的ＤＮＡ發(fā)生鏈間交聯(lián)，從而使ＤＮＡ解鏈溫度提高，導(dǎo)致在加熱至７０℃時(shí)ＤＮＡ仍未完全解鏈，因而７０℃條件下ＤＮＡ增色效應(yīng)較小，甚至很低。

綜合考慮污水灌溉對(duì)小麥幼苗葉片和根ＤＮＡ提取量以及損傷效應(yīng)的影響，應(yīng)采用清水、污水配比或者清水、污水輪灌的方式灌溉較為適宜，不宜直接用污水灌溉，更不宜長(zhǎng)期用污水灌溉。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 宰松梅，王朝輝，龐鴻賓． 污水灌溉的現(xiàn)狀與展望［Ｊ］．土壤，２００６，３８（６）：８０５-８１３．

［２］ 王立人，侯亞明．論鄭州市農(nóng)業(yè)污灌區(qū)土壤糧食的重金屬污染問題［Ｊ］．農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)，１９９１，１０（４）：１６１-１６４．

［３］ 高俠麗，王愛民，袁宗飛，等．污灌對(duì)蔬菜的生理生態(tài)指標(biāo)及細(xì)胞學(xué)影響研究［Ｊ］．中國環(huán)境科學(xué)，１９９７，１７（５）：４４３-４４５．

［４］ 孟雷，左強(qiáng)．污水灌溉對(duì)冬小麥根長(zhǎng)密度和根系吸水速率分布的影響［Ｊ］．灌溉排水學(xué)報(bào)，２００３，２２（４）：２５-２９．

［５］ 劉登義，王友保，張徐祥，等．污灌對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)及活性氧代謝的影響［Ｊ］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，２００２，１３（１０）：１３１９-１３２２．

［６］ 奚旦立，孫裕生，劉秀英．環(huán)境監(jiān)測(cè)［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２０００．９９-ｌ０２．

［７］ ＧＢ／Ｔ ７４７５－１９８７，水質(zhì) 銅、鋅、鉛、鎘的測(cè)定 原子吸收分光光度法［Ｓ］．

［８］ ＧＢ／Ｔ ７４６９－１９８７，水質(zhì) 總汞的測(cè)定 高錳酸鉀-過硫酸鉀消解法 雙硫腙分光光度法［Ｓ］．

［９］ 王關(guān)林，方宏筠．植物基因工程［Ｍ］．第二版．北京：科學(xué)出版社，２００２．７４２-７４４．

［１０］ 葛才林，楊小勇，孫錦荷，等．重金屬脅迫引起的水稻和小麥幼苗ＤＮＡ損傷［Ｊ］．植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，２００２，２８（６）：４１９-４２４．

［１１］ ＫＯＣＨ Ｃ Ｊ，ＧＩＡＮＤＯＭＥＮＩＣＯ Ａ Ｒ． Ｔｈｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｅｌｕｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ＤＮＡ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ： ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９４，２２０（１）：５８-６５．