潘鑫艷，王 麗，陳 玥，黎貴蕓，楊麗琳，楊舉倫

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphomas，NHL)最常見的類型，占所有NHL的30% ～40%，呈中 －高度惡性。DLBCL的形態(tài)學(xué)分型由于主觀性強(qiáng)、可重復(fù)性差，難以向臨床提供有效、準(zhǔn)確的治療和預(yù)后信息［1］。免疫組化技術(shù)對區(qū)分DLBCL的免疫學(xué)表型有重要的價(jià)值［2］，然而對于一些疑難病例，形態(tài)學(xué)和免疫組化也難以分辨。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因異常檢測逐漸成為惡性淋巴瘤診斷的重要補(bǔ)充手段［3］。免疫球蛋白(Ig)基因重排是B淋巴細(xì)胞克隆的特異性標(biāo)志［4-6］，是目前較適合區(qū)分DLBCL免疫學(xué)表型的檢測手段［7］。

2000年Alizadeh等［8］首先通過對基因表達(dá)譜結(jié)果分析，提出DLBCL可分為2型，即生發(fā)中心B細(xì)胞型(germinal center B-cell-like，GCB)和活化B細(xì)胞型(activated B-cell-like，ABC)。2004年 Hans等［9］以cDNA微陣列為參照對DLBCL進(jìn)行亞分類，提出DLBCL分為GCB和非GCB(non-GCB)2種類型，二者的預(yù)后不同［10-14］。目前大多數(shù)文獻(xiàn)只對其檢測率進(jìn)行探討，本實(shí)驗(yàn)利用BIOMED-2克隆分析系統(tǒng)研究DLBCL中Ig基因重排規(guī)律，探討GCB和non-GCB中Ig基因重排特點(diǎn)，以期為DLBCL的診斷及分型提供更為簡捷的檢測途徑，同時(shí)為臨床應(yīng)用提供更為可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本:收集成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科2010年1月—2012年1月經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的46例手術(shù)切除的淋巴組織病變標(biāo)本，全部標(biāo)本均經(jīng)2名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師結(jié)合形態(tài)學(xué)及免疫組化確認(rèn)為DLBCL，以15例反應(yīng)性增生病變作為陰性對照。

1.1.2 主要試劑:免疫組化試劑CD10、MUM1、Bcl-6購自Dako公司;QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit購自德國QIAGEN公司;10×PCR buffer、rTaq DNA聚合酶購自TaKaRa公司;2.5 mmol/L dNTP Mixture、6×Loading buffer、50 bp Marker購自天根生化科技公司;BIOMED-2引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法:采用Envision法，以PBS代替一抗作為空白對照，＞30%的腫瘤細(xì)胞染色陽性視為陽性病例。依據(jù)Hans等［9］方法對DLBCL進(jìn)行免疫分型，GCB組:CD10(+)或CD10(－)時(shí)，Bcl-6(+)，同時(shí)MUM1(－);non-GCB 組:CD10(－)，若Bcl-6(+)則同時(shí)MUM1(+)。

1.2.2 石蠟樣本基因組DNA提取:用75%乙醇擦拭刀片或使用新刀片以保證無交叉污染。視組織大小切8～10片，8 μm厚的石蠟切片置于1.5 ml滅菌離心管中，二甲苯脫蠟4次;無水乙醇重復(fù)3次去除二甲苯;37℃恒溫器干燥組織。用DNA提取試劑盒提取石蠟組織基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測量樣品DNA的濃度、純度，其OD260/OD280應(yīng)介于1.7 ～2.0，OD260/OD230≥1.7，對樣品不純或濃度不足的樣本重新提取DNA。

1.2.3 引物設(shè)計(jì):選用了BIOMED-2引物系統(tǒng)中檢測Ig基因克隆性重排的47條引物(表1)［15］，這些引物組合后應(yīng)用于檢測重鏈(IGH)和輕鏈(IGκ和IGλ)，其中IGH 分成5 組:IGH-A、B、C、D、E，用于檢測VH-JH;IGκ分成2組，用于檢測 Vκ-Jκ和 Vκκde，包括 IGκ-A、B;IGλ 用于檢測 Vλ-Jλ。同時(shí)還包含了內(nèi)對照S引物5條，其擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度分別為 100、200、300、400 和 600 bp。

表1 BIOMED-2標(biāo)準(zhǔn)化的基因重排分析引物系統(tǒng)

1.2.4 PCR 擴(kuò)增:采用 25 μl擴(kuò)增體系:0.1 μmol/L引物，10 × PCR buffer，0.2 mmol/L dNTP Mixture，2 U rTaq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性，10 min;94℃，45 s;60℃，45 s;72℃，90 s;循環(huán)40次，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.5 異源雙鏈核酸分子分析及聚丙烯酰胺電泳檢測:PCR 產(chǎn)物置于95℃、5 min，4℃、1 h，使其快速隨機(jī)復(fù)性，形成異源雙鏈核酸分子。取上述異源雙鏈核酸分子7 μl進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，以50 bp Marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)對照，0.5×TBE電泳緩沖液，電壓80 V、電泳10 min;而后電壓110 V、電泳1.0 ～1.5 h;EB 染色 5 min，紫外凝膠成像儀下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其中重(輕)鏈陽性率比較時(shí)，若該例標(biāo)本中同時(shí)擴(kuò)增出幾種重(輕)鏈反應(yīng)管的陽性條帶，則只統(tǒng)計(jì)為1例;而在統(tǒng)計(jì)每個(gè)反應(yīng)管的陽性率時(shí)，若該例標(biāo)本中擴(kuò)增出幾種重(輕)鏈反應(yīng)管陽性條帶就統(tǒng)計(jì)為幾例。所有數(shù)據(jù)均采用χ2檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化分型 采用CD10、MUM1、Bcl-6 3種抗體染色對DLBCL進(jìn)行蛋白水平分子分型［9］，將本實(shí)驗(yàn)選取的46例DLBCL劃分成 GCB 12例，non-GCB 34例。

2.2 DLBCL的Ig基因重排 46例DLBCL經(jīng)Ig基因重排分析顯示，除1例樣本因提取的基因組DNA降解嚴(yán)重導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗外，其余的45例樣本均擴(kuò)增出Ig克隆性重排條帶(圖1)，利用BIOMED-2引物系統(tǒng)對DLBCL的檢測敏感性為97.8%(45/46);15例反應(yīng)性增生病例中未出現(xiàn)Ig基因的克隆性重排，檢測特異性為100.0%(15/15)。46例樣本中IGH克隆性重排的陽性例數(shù)為42例(91.3%);IGκ克隆性重排的陽性例數(shù)為38例(82.6%)，IGλ克隆性重排的陽性例數(shù)為17例(37.0%);重排條帶主要集中于檢測重鏈的IGH-A、IGH-C反應(yīng)管以及檢測輕鏈的 IGκ-A、IGκ-B 反應(yīng)管(表2)。

表2 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤Ig基因重排檢測結(jié)果(n=46)

2.3 GCB和non-GCBIg基因重排比較 GCB和non-GCB重鏈IGH基因重排陽性率分別為91.6%(11/12)和 94.1%(32/34)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而輕鏈基因重排陽性率分別為58.3%(7/12)和91.2%(31/34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3。

表3 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤GCB和non-GCBIg基因重排檢測結(jié)果

圖1 彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤部分樣品Ig基因重排經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果

3 討論

DLBCL是一組臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)、免疫表型、生物學(xué)行為及預(yù)后等方面具有很大異質(zhì)性的大B淋巴細(xì)胞來源的腫瘤，其病理診斷是病理工作中的難點(diǎn)。一些DLBCL的鑒別、診斷、分型僅依靠形態(tài)學(xué)和免疫組化難以實(shí)現(xiàn)，病理醫(yī)師往往難以作出肯定的判斷，甚至誤診，受體基因重排的克隆性分析技術(shù)為解決這一問題提供了一條途徑。20世紀(jì)80年代末，分子生物學(xué)和分子細(xì)胞遺傳特征已成為DLBCL診斷和研究中不可缺少的部分［16］。近年來，PCR技術(shù)用于檢測Ig基因重排在DLBCL診斷與鑒別診斷中的作用獲得了肯定［17］。

Ig基因克隆性重排主要集中在重鏈可變區(qū)V基因，IGH之所以成為克隆性檢測的首選目標(biāo)，主要原因是由于大多數(shù)B細(xì)胞腫瘤均會發(fā)生IGH基因重排。因此，多年來研究者依據(jù)IGH基因來進(jìn)行克隆性檢測，而在應(yīng)用IGκ和IGλ方面，臨床實(shí)踐和研究均不多。但是理論和已經(jīng)發(fā)表的一些研究成果表明，對輕鏈的研究在一定程度上能夠提高克隆性重排檢出率［18］。以往研究顯示 B細(xì)胞淋巴瘤IGH基因重排的陽性檢出率為50% ～85%［16，19-20］。BIOMED-2方案是2003年由歐共體7國47個(gè)研究機(jī)構(gòu)研究建立的多重PCR引物系統(tǒng)［21］，該方案引入對IGκ和IGλ兩條輕鏈的檢測后，特別是IGκ包括了 Vκ-Jκ(IGκ-A)和 κde(IGκ-B)片段的檢測;而且κde重排方式也不受體細(xì)胞高突變的影響［22-23］，進(jìn)一步提高了對成熟B細(xì)胞性淋巴瘤的檢出率(95% ～100%)［18，24-26］。因此，在對 B 細(xì)胞淋巴瘤的基因重排檢測中對輕鏈的檢測也顯得尤為重要。

本研究利用BIOMED-2引物系統(tǒng)對46例DLBCL進(jìn)行了 Ig基因重排檢測，檢出率達(dá)到97.8%，檢測特異性為 100.0%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［25］。46例DLBCL樣本中 IGH克隆性重排的陽性檢出率為91.3%;IGκ克隆性重排的陽性檢出率為82.6%，其中IGκ-A克隆性重排的陽性檢出率為56.5%，高于文獻(xiàn)報(bào)道的 29.2%［27］;IGκ-B 克隆性重排的陽性檢出率為26.1%，與文獻(xiàn)報(bào)道的25.0%一致［27］。IGλ克隆性重排的陽性檢出率為37.0%。結(jié)果顯示IGH克隆性重排的陽性檢出率最高，IGκ次之，IGλ最低。

2008年WHO將DLBCL進(jìn)行免疫學(xué)分型，分為GCB和non-GCB 2種類型［28］。這2種分子類型的DLBCL患者預(yù)后差別顯著，5年生存率分別為70%和12%，non-GCB組比GCB組低，若對DLBCL患者早期診斷、根據(jù)分型予強(qiáng)力化療，近半數(shù)可獲得緩解［29］。因此，早期診斷、治療對提高DLBCL患者的生存率意義重大。本研究討論了DLBCL GCB和non-GCB中，Ig基因重鏈(IGH)和輕鏈(IGκ和IGλ)的重排規(guī)律和特點(diǎn)，力求找到一種更為簡捷、準(zhǔn)確的檢測途徑。研究結(jié)果顯示，GCB和non-GCB的重鏈IGH基因重排差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而輕鏈重排條帶分布具有顯著的特點(diǎn)和規(guī)律:GCB的IGκ-B克隆性重排的陽性檢出率明顯高于non-GCB型，IGκ-A、IGλ克隆性重排的陽性檢出率明顯低于non-GCB型。蔣會勇等［30］利用半巢式PCR對GCB進(jìn)行了IGH基因重排相關(guān)性檢測，結(jié)果顯示IGH基因重排的檢測可協(xié)助確定部分GCB的DLBCL。然而通過本研究發(fā)現(xiàn)，輕鏈基因的重排檢測也可以協(xié)助DLBCL分型。

目前，大多數(shù)文獻(xiàn)通過免疫組化對non-GCB和GCB預(yù)后進(jìn)行研究表明，前者預(yù)后比后者差，而Ig基因重排與其預(yù)后關(guān)系的研究甚為少見［10，29，31-34］。本文發(fā)現(xiàn)GCB和non-GCB中輕鏈重排條帶差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該現(xiàn)象與其預(yù)后是否關(guān)聯(lián)，尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。對于一些疑難病例，特別是早期和微量標(biāo)本，基因診斷尤有獨(dú)到之處，但當(dāng)基因重排檢測與病理組織學(xué)及免疫組化結(jié)果有沖突的時(shí)候，務(wù)必將3種檢查結(jié)合起來綜合分析［35-37］。

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