麻 攀，于煒婷，魏 鵬，許青松，白雪芳，杜昱光*

1中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所1805組，大連 116023;2中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

殼寡糖作用于巨噬細(xì)胞的機制初探

麻 攀1，2，于煒婷1，2，魏 鵬1，2，許青松1，白雪芳1，杜昱光1*

1中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所1805組，大連 116023;2中國科學(xué)院研究生院，北京 100049

研究殼寡糖對免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞作用的具體機制。結(jié)合流式細(xì)胞儀和激光共聚焦實驗檢測殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用，通過凝膠阻滯實驗在體外驗證殼寡糖的胞內(nèi)定位。實驗結(jié)果證明殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用過程如下，先與細(xì)胞膜結(jié)合，然后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，最后定位在細(xì)胞核的核酸(DNA/RNA)上。

殼寡糖;巨噬細(xì)胞;DNA;RNA

巨噬細(xì)胞是機體內(nèi)具有強大吞噬功能的細(xì)胞，廣泛分布于全身各處組織內(nèi)。它不僅擔(dān)負(fù)著機體的非特異性防御功能，不斷清除外源異物、體內(nèi)衰老以及變異細(xì)胞，并且還可以作為抗原呈遞細(xì)胞將特異性免疫應(yīng)答和非特異性免疫應(yīng)答相連從而輔助機體免疫。幾丁質(zhì)的脫乙酰降解產(chǎn)物殼寡糖因其不但具有幾丁質(zhì)、殼聚糖的許多生理活性之外，如抗菌［1］，抗氧化［2］，抗腫瘤［3，4］和免疫調(diào)節(jié)［5］等，還具有分子量小、毒性低、水溶性好等幾丁質(zhì)和殼聚糖所不具備的優(yōu)點，因此已經(jīng)越來越受到人們的青睞。本實驗通過相應(yīng)方法驗證了殼寡糖與巨噬細(xì)胞的相互作用機制以及殼寡糖在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)定位，這將為今后相關(guān)的研究提供了較好的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要藥品試劑、儀器

殼寡糖:本實驗室生產(chǎn)(聚合度2-8，脫乙酰度大于95%)，RAW264.7巨噬細(xì)胞株(上海細(xì)胞庫)，RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液(sigma)，胎牛血清(杭州四季青)，2-AMAC(sigma)，CO2培養(yǎng)箱(德國 Heraeus公司)，離心機(德國 Heraeus公司)，激光共聚焦(Leica SP2型)，流式細(xì)胞儀(BD FACSVantage SE)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(加入100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)，在條件為5%CO2濃度，37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，三天傳一代。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測殼寡糖與巨噬細(xì)胞的結(jié)合

選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(1×105個/mL)，用0.1 M PBS洗三遍，離心(1000 rpm，5 min)回收細(xì)胞。殼寡糖用熒光標(biāo)記物2-AMAC標(biāo)記［6］，以下簡稱之為2-AMAC-COS。將回收的細(xì)胞分別與2-AMAC或2-AMAC-COS在4℃下孵育15 min。殼寡糖競爭組則將細(xì)胞與2-AMAC-COS在4℃下孵育15 min后，再與未標(biāo)記殼寡糖4℃下孵育15 min，用4%多聚甲醛固定液固定，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為520 nm。全過程在避光條件下進(jìn)行。

1.2.3 激光共聚焦檢測殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用

將處于對數(shù)生長期的巨噬細(xì)胞(1×105個/ mL)等量地接種到蓋玻片上，讓其貼壁24 h形成細(xì)胞單層。取出帶有細(xì)胞單層的蓋玻片用0.1 M PBS洗三遍后，分別與2-AMAC或2-AMAC-COS在37℃下孵育指定的時間。PBS洗三遍，用4%多聚甲醛固定液固定后，進(jìn)行激光共聚焦檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為520 nm。全過程在避光條件下進(jìn)行。

1.2.4 DNA/RNA結(jié)合實驗

用CTAB法提取細(xì)胞總基因組DNA，Trizol試劑盒(寶生物，大連)提取細(xì)胞總RNA。分別用300 ng基因組DNA或1 μg總RNA與殼寡糖以相應(yīng)比例在室溫下孵育30 min后，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。DNA組用0.5%瓊脂糖凝膠檢測，RNA組用1%瓊脂糖凝膠檢測。RNA組全過程用具均用DEPC水處理以去除RNA酶降解影響。DNA組中已用RNA酶處理去除RNA干擾。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)結(jié)果均重復(fù)三遍以上以確保準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果和討論

2.1 殼寡糖與巨噬細(xì)胞的結(jié)合

流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)殼寡糖與巨噬細(xì)胞有較明顯地結(jié)合作用。圖1.A顯示，用熒光標(biāo)記物2-AMAC標(biāo)記殼寡糖后，讓其與巨噬細(xì)胞在4℃下結(jié)合15 min，熒光峰明顯右移，熒光值顯著增強，表明熒光標(biāo)記殼寡糖明顯地結(jié)合到巨噬細(xì)胞上。當(dāng)用未標(biāo)記的殼寡糖競爭這種結(jié)合作用后，發(fā)現(xiàn)可以顯著競爭掉熒光標(biāo)記殼寡糖與巨噬細(xì)胞的結(jié)合(圖1.B)，表明殼寡糖與巨噬細(xì)胞的這種結(jié)合作用是可逆的。

2.2 殼寡糖與巨噬細(xì)胞的相互作用

發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以與巨噬細(xì)胞可逆地結(jié)合后，我們更希望直觀地看到殼寡糖與巨噬細(xì)胞的相互作用的過程，因此我們用激光共聚焦實驗來進(jìn)行下一步驗證。如圖2所示，隨著時間的遞進(jìn)，殼寡糖與巨噬細(xì)胞的相互作用是一種有序的過程。首先，殼寡糖結(jié)合到細(xì)胞的表面，隨著時間延長，殼寡糖進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，最后定位到細(xì)胞核內(nèi)(如圖中箭頭所示)。而熒光標(biāo)記物2-AMAC只是彌散在細(xì)胞內(nèi)，并且其熒光強度要明顯低于2-AMAC-COS。因為其分子量較小，它可能是通過被動擴散的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的，而2-AMAC-COS則可能是一種受體介導(dǎo)的方式。殼寡糖進(jìn)入細(xì)胞的方式我們會在接下來的實驗中繼續(xù)驗證。

2.3 殼寡糖與核酸(DNA/RNA)的體外結(jié)合作用

在圖2中我們發(fā)現(xiàn)殼寡糖可以明顯地定位在核內(nèi)，因此，我們想證明殼寡糖是定位在核內(nèi)的哪些部位。我們用凝膠阻滯實驗(gel-retardation assay)在體外驗證了殼寡糖與DNA/RNA的結(jié)合作用。圖3指出殼寡糖能明顯地阻止核酸在膠內(nèi)的遷移，并且這種阻止作用隨著殼寡糖與核酸比例的增加而逐漸增強，殼寡糖與DNA的結(jié)合效果要好于RNA。表明殼寡糖在細(xì)胞核內(nèi)是定位在核酸上。當(dāng)然，也不排除其有可能也會定位在某些核內(nèi)蛋白上，在接下來的實驗中，我們也會做相應(yīng)的驗證。

圖3 殼寡糖與DNA/RNA體處結(jié)合作用Fig.3 The binding between COS and DNA/RNAin vitro

3 結(jié)論

本實驗驗證了殼寡糖與巨噬細(xì)胞相互作用的機制以及其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的定位情況。它是以一種有序的方式作用于細(xì)胞，首先與細(xì)胞膜可逆地結(jié)合，然后進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，最后定位在核內(nèi)的核酸(DNA/RNA)上。

1 Qin CQ，Li HR，Xiao Q，et al.Water-solubility of chitosan and its antimicrobial activity.Carbohydr Polym，2006，63: 367-374.

2 Huang RH，Rajapakse N，Kim SK.Structural factors affecting radical scavenging activity of chitooligosaccharides(COS) and its derivatives.Carbohydr Polym，2006，63:122-129.

3 Xu QS，Dou JL，Wei P，et al.Chitooligosaccharides induce apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells via upregulation of Bax.Carbohydr Polym，2008，4:509-514.

4 Xu QS，Wei P，Dou JL，et al.Studies on the Inhibitory effects of oligochitosan on SMMC-7721 cells of hepatocarcinoma.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2009，21:152-154.

5 Dou JL，Tan CY，Du YG，et al.Effects of chitooligosaccharides on rabbit neutrophils in vitro.Carbohydr Polym，2007，69:209-213.

6 Zhao XM，She XP，Yu W，et al.Effects of oligochitosans on tobacco cells and role of endogenous nitric oxide burst in the resistance of tobacco to Tobacco mosaic virus.J Plant Pathol，2007，89:55-65.

Mechanisms of Chitosan Oligosaccharides Acting on Macrophage

MA Pan1，2，YU Wei-ting1，2，WEI Peng1，2，XU Qing-song1，BAI Xue-fang1，DU Yu-guang1*

1Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China;2Graduate School of Chinese Academy Sciences，Bejing 100049，China

The molecular mechanisms of chitosan oligosacchrides(COS)acting on macrophages in immune system were investigated here.Through Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM)and Flow cytometric analysis，we examined the interaction between COS and macrophages.Gel-retardation experiment was used to investigate the location of COS in the nucleus.The results suggested that the interaction between COS and macrophages was followed in proper sequence.First，COS bound to the plasma membrane of macrophage cells before entering into the cytoplasm，and lastly，it was located on DNA/RNA in the nucleus.

chitosan oligosaccharides(COS);macrophage;DNA;RNA

R392.12

A

1001-6880(2012)05-0660-03

2010-11-26 接受日期:2011-04-08

國家科技重大專項課題(2009ZX095010)新藥研究開發(fā)關(guān)鍵技術(shù)研究

*通訊作者 Tel:86-411-84379060;E-mail:articles1805@gmail.com