楊文曲，韓沖芳，范作雷

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外大量研究證明［1－3］，腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)元損傷與凋亡機(jī)制有關(guān)。Bcl－2和Caspase－3作為凋亡途徑重要的成員，其表達(dá)的變化對(duì)細(xì)胞的命運(yùn)起決定作用。本研究通過(guò)夾閉法建立缺血再灌注模型，七氟烷后處理進(jìn)行干預(yù)檢測(cè)Bcl－2和 Caspase－3 的 表 達(dá)，研 究 七 氟 烷 后 處 理 與 Bcl－2 和Caspase－3的表達(dá)關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重250g～300g（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（C組）、缺血再灌注組（IP組）、1．0MAC七氟烷后處理組（S1組）和1．5MAC七氟烷后處理組（S2組），每組10只。

1．2 模型制備 10%水合氯醛300mg／kg腹腔內(nèi)注射麻醉，仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，經(jīng)口氣管內(nèi)插管（18G靜脈留置針），接ALC－V8動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾特生物科技有限公司）控制呼吸。取頸部正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈。無(wú)損傷動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈［4］，雙側(cè)頸總動(dòng)脈頭側(cè)搏動(dòng)消失為腦缺血成功的標(biāo)志。20min后去除動(dòng)脈夾恢復(fù)再灌注，搏動(dòng)恢復(fù)為再灌注成功的標(biāo)志?？p合頸部切口，將大鼠放回籠中，自由飲食。

1．3 七氟烷給藥 呼吸機(jī)進(jìn)氣口與七氟烷揮發(fā)罐的出口端相連，揮發(fā)罐入口端與醫(yī)用氧氣罐出口端連接。呼吸頻率70次／min，吸呼比1∶2，潮氣量（5～8）mL／kg，F(xiàn)iO2＝100%。調(diào)節(jié)七氟烷揮發(fā)罐，吸入濃度為1．0MAC或1．5MAC（分別為2．4%和3．6%），吸入15min。實(shí)驗(yàn)中采用白熾燈泡持續(xù)燈照加溫維持37．0℃～37．5℃。

1．4 Bcl－2和Caspase－3檢測(cè) 再灌注24h后斷頭取腦海馬組織，4%甲醛固定2h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋切片，切片常規(guī)脫蠟至水，滴加3%H2O2室溫下10min，蒸餾水洗3min×3次，微波修復(fù)抗原，滴加5%BSA血清封閉液，室溫下20min，滴加Ⅰ抗（Caspase－3兔抗大鼠多克隆抗體或Bcl－2兔抗大鼠多克隆抗體），37℃孵育120min，PBS洗2min×3次，滴加Ⅱ抗（免疫組化SP法羊抗兔二抗試劑盒），37℃孵育20min，PBS洗2min，3次，滴加試劑SABC，37℃反應(yīng)20min，PBS洗5min，4次，DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察，光鏡下胞漿著色呈棕黃色為細(xì)胞陽(yáng)性。每張切片高倍（400倍）鏡下隨機(jī)選取相互不重疊的3個(gè)視野，利用BI－2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟）測(cè)定Caspase－3、Bcl－2蛋白平均灰度值。平均灰度值大小代表陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)的多少，平均灰度值大表明陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)的少。免疫組化試劑購(gòu)于武漢博士得公司。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13．0分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

與C組相比，IP組Bcl－2的平均灰度值顯著增加（P＜0．05）、Caspase－3的平均灰度值顯著減少（P＜0．05），組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1 各組Bcl－2、Caspase－3平均灰度值比較（±s）

表1 各組Bcl－2、Caspase－3平均灰度值比較（±s）

與C組比較，1）P＜0．05；與IP組相比，2）P＜0．05；與S1組相比，3）P＜0．05

組別 Bcl－2 Caspase－3 C組 157．24±16．09 116．10±17．64 IP組 168．13±7．251） 82．15±15．701）S1組 132．94±12．281）2） 136．69±15．711）2）S2組 104．10±12．931）2）3） 165．37±9．681）2）3）

3 討 論

缺血后處理作為近年來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域探討的一個(gè)熱點(diǎn)，將對(duì)組織器官的保護(hù)具有不可估量的作用。由于七氟烷具有血?dú)夥峙湎禂?shù)低、誘導(dǎo)迅速、蘇醒快、體內(nèi)蓄積少、對(duì)呼吸道抑制小、血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定等特點(diǎn)，因此成為臨床吸入麻醉的首選。七氟烷對(duì)組織臟器具有保護(hù)作用。2006年Zhao等［5］采用夾閉雙頸動(dòng)脈（15～30）min在再灌注前進(jìn)行后處理，可減少腦梗死面積。Jiang等［6］研究發(fā)現(xiàn)，將后處理延遲至再灌注后10min之后進(jìn)行將失去保護(hù)作用。郝宇華等［7］發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物模型的血腦組織在再灌注后24h細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰。因此選用夾閉雙頸總動(dòng)脈20min在再灌注前進(jìn)行七氟烷后處理15min，24h后斷頭取腦進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

現(xiàn)認(rèn)為細(xì)胞凋亡最主要發(fā)起者和執(zhí)行者是線粒體，線粒體上的Bcl－2可通過(guò)調(diào)節(jié)膜的通透性，阻止線粒體細(xì)胞色素C的釋放而拮抗細(xì)胞凋亡［8］。Bcl－2的過(guò)度表達(dá)可引起細(xì)胞核谷胱苷肽聚積，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡改變，從而使活化的Caspase－3被阻斷［9］。Caspase－3作為內(nèi)源性凋亡調(diào)節(jié)基因，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者。不同的蛋白酶激活Caspase－3酶原，使Caspase－3活化，活化的Caspase－3進(jìn)一步通過(guò)水解特異性蛋白，抑制蛋白合成而激活細(xì)胞凋亡［10］。樊哲銘等［11］研究證明，缺血可使皮質(zhì)神經(jīng)元Caspase－3表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血再灌注組Caspase－3表達(dá)增加、Bcl－2表達(dá)減少，說(shuō)明該組細(xì)胞凋亡嚴(yán)重。七氟烷后處理Bcl－2表達(dá)增加、Caspase－3表達(dá)減少，說(shuō)明七氟烷后處理可減少細(xì)胞的凋亡，且1．5MAC七氟烷后處理組保護(hù)作用優(yōu)于1．0MAC七氟烷后處理組。

七氟烷后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Bcl－2蛋白表達(dá)，下調(diào)Caspase－3蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，但其確切的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

［1］ 熊利澤，楊靜，徐寧，等．缺血后處理對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響［J］．中華麻醉學(xué)雜志，2005，25（1）：508－510．

［2］ 夏明，董海龍，謝克，等．七氟醚后處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］．中華麻醉學(xué)雜志，2008，24：434－436．

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［4］ Werner C，Mollenberg O，Kochs E，et al．Sevoflurane improves neurological outcome after incomplete cerebral ischaemia in rats［J］．Br Anaesth，1995，75：756－760．

［5］ Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK，et al．Interrupting reperfusion as a stroke therapy：Ischemic postconditioning reduces infar ct size after focal ischemia in rats［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2006，26：1142－1121．

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［10］ 張慧，尹琳，劉麗梅．腦缺血后處理對(duì)大鼠海馬Caspase－3表達(dá)的影響［J］．中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2010，13：8－10．

［11］ 樊哲銘，索愛(ài)琴，許予明，等．氧、糖剝奪處理后Caspase－3在體外培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元變化及意義［J］．中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2007，10：84－86．