曲 巍 劉 鋒 姬西寧 王立明 朱有華

1.解放軍第一六一醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430010；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院器官移植研究所，上海 200003

膀胱癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年有350000例以上的新發(fā)病例，并且有145 000 人死于此病[1]。其生物學(xué)行為呈多樣性，而容易復(fù)發(fā)是其重要生物學(xué)特性。目前對其發(fā)生、復(fù)發(fā)、浸潤及轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全明了，大部分膀胱癌在確診時是表淺性的，經(jīng)過局部手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率為50%～70%，進(jìn)展率為15%～30%?，F(xiàn)有的傳統(tǒng)抗腫瘤藥物治療尚有一定的局限性，從新的角度尋求有效的抗腫瘤藥物有望取得突破性進(jìn)展。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deactylase inhibitors，HDAC抑制劑）是一類通過抑制組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的化合物，依其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為六類，而MS-275 是苯酰胺類HDAC抑制劑中最具活性的一種化合物，其顯示出對一些血液系統(tǒng)腫瘤[2]和實(shí)體腫瘤[3]有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)將探討MS-275 對膀胱癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人膀胱癌T24 細(xì)胞來源于中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所，實(shí)驗(yàn)時取對數(shù)生長期的細(xì)胞，在含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在 37℃、5%CO2、飽和濕度條件下生長，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2 MTT實(shí)驗(yàn)

T24 細(xì)胞以 5 ×104/mL、100 μL/孔， 接種于 96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng) 24 h 后，分別加入濃度為 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L的MS-275 作為5個實(shí)驗(yàn)組，陰性對照組不加MS-275，空白對照組為單純DMEM培養(yǎng)液，每組各設(shè)5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，再培養(yǎng) 4 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加100 μL二甲基亞砜（DMSO），酶標(biāo)儀測定吸光度，選擇492 nm波長，用空白對照組調(diào)零，計算細(xì)胞生長抑制率（%）＝（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度/對照組吸光度）×100%。以細(xì)胞生長抑制率與藥物濃度的對數(shù)作圖，在圖上求出MS-275 對T24 細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）值。選取接近于IC50 值的濃度用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 熒光顯微鏡觀察凋亡的形態(tài)學(xué)變化

將T24 細(xì)胞以1 ×105/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，觀察細(xì)胞貼壁且生長良好后，加入濃度為4.0 μmol/L的MS-275 作為實(shí)驗(yàn)組，非藥物處理組作為對照組，繼續(xù)分別培養(yǎng)12、24、48 h，細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化收集后，以磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)整細(xì)胞密度為 1 ×106/mL，制成單細(xì)胞懸液，取 95 μL細(xì)胞懸液，加人100 μg/ml的吖啶橙染液 5 μL 混勻，取 10 μL 混合液于載玻片上，加蓋玻片后于熒光顯微鏡（Olympus BX60）下（515 nm激發(fā)光）觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并攝片。

1.4 原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測細(xì)胞凋亡

4 μmol/L 的 MS-275 分別處理細(xì)胞 12、24、48 h，設(shè)陰性對照，每個時間點(diǎn)設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞懸液，做細(xì)胞涂片，行TUNEL法處理及染色，并以二氨基聯(lián)苯胺顯色。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，分析細(xì)胞凋亡率。

1.5 流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞內(nèi)Bcl-2 和Bax的變化

4 μmol/L 的 MS-275 分別處理細(xì)胞 12、24、48 h，收集后4%多聚甲醛固定，PBS液漂洗2次，加入1.5 mL破膜劑透化15 min后，離心去上清，重懸于150 μL破膜劑中，分別加入Bcl-2 和Bax的單克隆抗體，留取空白對照（不加單抗），避光反應(yīng)30 min，PBS漂洗2次，每管加入FITC熒光標(biāo)記的二抗，避光反應(yīng)30 min，PBS漂洗2次，上FCM檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng) MTT 法測定，濃度分別為 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L的MS-275 處理T24 細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的生長抑制率分別為（4.59 ±2.37）%、（9.86 ±6.74）%、（22.82 ±7.55）%、（41.17 ±6.14）%、（65.02 ±6.21）%，通過作圖求得 IC50 為（5.21 ±0.61）μmol/L。 選用接近IC50的4.0 μmol/L濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

對照組基本為正常細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，胞核DNA呈現(xiàn)黃綠色均勻彌散熒光。MS-275 處理12 h和24 h凋亡細(xì)胞逐漸增多，48 h后出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)核固縮，呈現(xiàn)致密濃染的黃綠色熒光，部分細(xì)胞表現(xiàn)為核碎裂，還可見典型的出泡現(xiàn)象。見圖1。

2.3 MS-275 誘導(dǎo)T24 細(xì)胞凋亡率（AI）的升高

MS-275 誘導(dǎo)T24 細(xì)胞凋亡呈明顯的時間依賴性，T24細(xì)胞的凋亡率隨MS-275 作用時間的延長而升高。MS-275作用 12、24、48 h 的 AI分別為（9.52 ±2.61）%、（17.76 ±3.75）%和（37.5 ±5.26）%，AI在 MS-275 作用 12 h 以上各組，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 MS-275 對Bcl-2 和Bax表達(dá)的影響

MS-275 作用 6、12 h，T24 細(xì)胞內(nèi) Bcl-2 蛋白的表達(dá)率即出現(xiàn)明顯降低，而同時Bax蛋白的表達(dá)率出現(xiàn)明顯升高（P＜0.05 或 P＜0.01）；24 h Bax的蛋白表達(dá)率逐漸降低 （P＜0.01）；此后隨著作用時間的延長，Bcl-2 的蛋白表達(dá)率逐漸升高，而Bax的蛋白表達(dá)率逐漸降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。 見表1。

表1 MS-275對T24細(xì)胞Bcl-2，Bax蛋白表達(dá)率的影響（±s，%）

表1 MS-275對T24細(xì)胞Bcl-2，Bax蛋白表達(dá)率的影響（±s，%）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 Bcl-2 Bax對照組6 h 12 h 24 h 48 h 15.31 ±2.15 9.94 ±2.56*9.81 ±2.07*12.30 ±3.23 14.97 ±3.71 47.53 ±5.95 83.3 ±8.94**90.32 ±5.29**72.56 ±6.93**49.23 ±7.12

3 討論

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是HDAC抑制劑抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)用熒光染色法及TUNEL法觀察到，微摩爾數(shù)量級的MS-275 即可誘導(dǎo)T24 細(xì)胞出現(xiàn)特征性的凋亡形態(tài)學(xué)改變，并且隨作用時間的延長，凋亡細(xì)胞的相對數(shù)量呈增多趨勢。隨后的實(shí)驗(yàn)對其誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

抗腫瘤治療可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)的損傷信號起反應(yīng)，而細(xì)胞是否凋亡很大程度上決定于Bcl-2 家族蛋白之間的相互作用[4]。Bcl-2 是Bcl-2 基因家族中調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一個重要分子，能廣泛抑制各種凋亡誘導(dǎo)因素引發(fā)的凋亡，其很可能影響凋亡最終通路上的中心環(huán)節(jié)。另一個Bcl-2 家族蛋白Bax是重要的異二聚體伴分子，可與Bcl-2 構(gòu)成異二聚體，而Bax自身組成同二聚體。Bcl-2 必須結(jié)合Bax才能發(fā)揮作用。Bcl-2 與Bax蛋白量的比率決定異二聚體（Bcl-2/Bax）與同二聚體（Bax/Bax）的比值，這對決定細(xì)胞的凋亡易感性起關(guān)鍵作用[5]。本實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果表明，MS-275 作用T24 細(xì)胞后Bcl-2 的表達(dá)減弱，Bax的表達(dá)增強(qiáng)，說明MS-275 可下調(diào)Bcl-2 表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，這與HDAC抑制劑誘導(dǎo)其他惡性腫瘤細(xì)胞凋亡時對凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響相一致[6-7]。本實(shí)驗(yàn)還觀察到MS-275 引起B(yǎng)ax表達(dá)的改變較Bcl-2 的改變更明顯，而由于Bcl-2 和Bax表達(dá)的改變是同步的，這樣就引起B(yǎng)ax/Bcl-2 發(fā)生更顯著的變化。更重要的一點(diǎn)在于，凋亡率發(fā)生顯著變化之前，Bcl-2 和Bax的表達(dá)即已發(fā)生顯著的改變，這更表明Bcl-2 和Bax表達(dá)的改變是MS-275 誘導(dǎo)凋亡的啟動環(huán)節(jié)上的作用因素。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HDAC抑制劑MS-275 通過誘導(dǎo)膀胱癌T24 細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，Bcl-2 和Bax蛋白表達(dá)分別下調(diào)和上調(diào)是其誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。HDAC抑制劑為膀胱癌的治療提供了新的思路。

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