郝春影，朱思斯，史怡冰，馬英麗

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

菊花是菊科植物菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat)的干燥頭狀花序。主要治療頭痛、眩暈、目赤、心胸煩熱、疔瘡、腫毒等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明，菊花具有治療冠心病、降低血壓、預防高血脂、抗菌、抗病毒、抗炎、抗衰老等多種藥理活性［1］?！吨袊幍洹?2005年版)根據(jù)菊花產(chǎn)地和加工方法的不同，收載了亳菊(亳州)、滁菊(滁州)、貢菊(黃山)和杭菊(杭州)四個品種。菊花為藥食同源植物，國內(nèi)外對其分類、鑒定、化學、臨床、藥理等方面均有報道。本文應(yīng)用比色法對四個不同產(chǎn)地的菊花中總黃酮和總?cè)频暮窟M行了測定。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

756型分光光度儀(上海光譜儀器廠);AB204－N電子天平(上海梅特勒－托利多儀器有限公司);HH.S.1－V電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療儀器廠)。

1.2 實驗試劑

蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所);齊墩果酸標準品(中國藥品生物制品檢定所);所用試劑均為分析純;水為蒸餾水。

1.3 實驗樣品

貢菊500g、亳菊500g(購于三棵樹中藥材批發(fā)市場－泰山藥材店);杭菊500g(購于哈爾濱香坊區(qū)天好大藥房);滁菊500g(郵購于全椒縣武夷茶莊)。

2 試驗方法

2.1 正交法優(yōu)化提取工藝

以乙醇為提取溶劑，以總黃酮和總?cè)频奶崛÷蕿樵囼炛笜?，選取 L9(34)正交表進行實驗［2－5］，具體見表1～表3。

表1 回流提取正交試驗設(shè)計

表2 超聲萃取正交實驗設(shè)計

表3 溫浸正交試驗設(shè)計

2.2 樣品提取

對于回流提取法，稱取5g貢菊粗粉，超聲和溫浸稱取2g貢菊粗粉，按正交試驗表所列條件，對樣品進行提取，合并提取液，于蒸發(fā)皿上蒸干，稱重，取適量置于25ml容量瓶中，加70%乙醇溶液定容，得供試品溶液。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 標準曲線繪制

精密稱取經(jīng)50℃恒溫干燥1h的蘆丁對照品20.1mg，用70%乙醇定容于25ml容量瓶中，精密吸取0.0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4ml置于 25ml容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液1ml，振搖，放置6min，再加入10%硝酸鋁溶液1ml，振搖，放置6min，再加入4%氫氧化鈉溶液10ml，加70%乙醇至刻度，搖勻，放置15min［6］，于512nm波長下測定吸光度，以濃度C為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，得線性回歸方程為y=10.833x+0.001 2(r=0.008 5)。

2.3.2 正交試驗結(jié)果分析 見表4～表6。

表4 回流提取正交實驗結(jié)果

表5 超聲萃取正交試驗結(jié)果

通過上述數(shù)據(jù)分析，得出三種提取方法的最佳提取工藝分別為:

回流提取法:A1B2C2D2，即50%乙醇1.5h 2次料液比1∶20。

超聲萃取法:A1B3C2D3，即50%乙醇30min 2次料液比1∶25。

溫浸法:A2B3C1，即70%乙醇4h料液比1∶20。

為比較三種提取方法中最佳工藝，將所得最佳工藝分別平行做三組，進行含量測定，結(jié)果見表7。

表6 溫浸正交試驗結(jié)果

表7 最佳工藝篩選(%)

通過結(jié)果得知，總黃酮的最佳提取工藝為50%乙醇1.5h 2次料液比1∶20回流提取。

2.4 總?cè)坪繙y定

2.4.1 標準曲線繪制

精密稱取經(jīng)50℃恒溫干燥1h的齊墩果酸對照品4.4mg，用70%乙醇定容于25ml容量瓶中，分別精密吸取 0.0，1.0，1.6，2.2，2.8，3.4，4.0ml置于 20ml具塞磨口試管中，水浴蒸干，加入新鮮配制的5%香草醛－冰乙酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，迅速搖勻，將試管置于60℃水浴中加熱15min，拿出用冰水浴迅速冷卻至室溫，加乙酸乙酯至 10ml［7－8］。于 550nm 波長下測定吸光度A，以濃度C為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，得線性回歸方程 y=17.356x+0.062 7(r=0.994 4)。

2.4.2 正交試驗結(jié)果分析結(jié)果 見表8～10。

通過上述數(shù)據(jù)分析，得出三種提取方法的最佳提取工藝分別為:

回流提取法:A2B2C2D1，即70%乙醇1.5h 2次料液比 1∶15。

超聲萃取法:A1B1C2D3，即50%乙醇10min 2次料液比 1∶25。

溫浸法:A2B2C3，即70%乙醇3h料液比1∶30。

為比較三種提取方法中最佳工藝，將所得最佳工藝分別平行做三組，進行含量測定，結(jié)果見表11。

表8 回流提取正交實驗結(jié)果

表9 超聲萃取正交試驗結(jié)果

表10 溫浸正交試驗結(jié)果

表11 最佳工藝篩選(%)

通過以上結(jié)果得知，總?cè)频淖罴烟崛」に嚍?0%乙醇3h料液比1∶30溫浸法。

3 方法學測定

3.1 黃酮提取方法學測定

3.1.1 精密度試驗

精密吸取標準品溶液 1.2ml，按2.2.2.1 下操作，測定吸光度A，RSD為:0.318 3%。

3.1.2 穩(wěn)定性試驗

取供試品液，每過1h分別測定吸光度，樣品提取率RSD為:0.067 5%，說明供試品液在7h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.3 重現(xiàn)性試驗

取供試品液，在短時間內(nèi)測定吸光度，樣品提取率RSD為:1.277 3%。

3.1.4 加樣回收率試驗

加樣回收率分別為:102.3%，98.5%，101.4%，分別計算RSD為:0.55%，0.51%，0.38%。

3.2 總?cè)铺崛》椒▽W測定

3.2.1 精密度試驗

精密吸取標準品溶液 2.5ml，按2.2.2.2 下操作，測定吸光度A，RSD為:0.32%。

3.2.2 穩(wěn)定性試驗

取供試品液，每過1h分別測定吸光度，樣品提取率RSD為:2.78%，說明供試品液在4h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.3 重現(xiàn)性試驗

取供試品液，在短時間內(nèi)測定吸光度，樣品提取率RSD為:4.68%。

3.2.4 加樣回收率試驗

加樣回收率分別為:100.6%，99.7%，101.2%，分別計算RSD為:1.23%，3.25%，2.72%。

4 結(jié)果與討論

4.1 對不同品種菊花中總黃酮和總?cè)坪窟M行測定

根據(jù)所得到的總黃酮和總?cè)频淖罴烟崛」に嚪謩e對貢菊、杭菊、滁菊、亳菊進行提取，并進行含量測定，結(jié)果見表12。

表12 各菊花黃酮及三萜的提取率(%)

由上表可見，總黃酮的提取率分別為:貢菊8.255 7%，杭菊9.644 8%，滁菊7.865 2%，亳菊6.447 5%。其中以杭菊的總黃酮含量最高，杭菊質(zhì)量最佳。總?cè)频奶崛÷史謩e為:貢菊1.046 7%，杭菊1.103 4%，滁菊2.095 4%，亳菊1.656 6%。其中以滁菊的總?cè)坪孔罡撸|(zhì)量最佳。

4.2 討論

菊花為藥食同源的常用中藥，其主要活性成分為黃酮、三萜類等化合物，具有多種藥理活性，在心血管、抗病毒、抗腫瘤等方面活性研究報道較多。但因其產(chǎn)地不同，菊花中有效成分的含量將有所差異。目前國內(nèi)對菊花的質(zhì)量研究主要集中在對黃酮的含量測定，尚未見到對不同產(chǎn)地菊花中黃酮及三萜同時測定的相關(guān)報道。本課題對不同產(chǎn)地菊花中黃酮、三萜類化合物進行含量測定和含量比較，通過比較來對不同產(chǎn)地菊花進行質(zhì)量初步評價。課題利用比色法對不同產(chǎn)地菊花中黃酮及三萜的含量進行測定和含量比較。

本課題采用正交試驗法分別得出了從菊花中總黃酮和總?cè)频淖顑?yōu)提取方法，總黃酮的為50%乙醇料液比1∶20回流提取1.5h、2次，總?cè)频臑?0%乙醇料液比1∶30溫浸3h。

含量分析結(jié)果表明，四個不同產(chǎn)地的菊花總黃酮和總?cè)坪坎灰?，它們分別含總黃酮量為杭菊＞貢菊＞滁菊＞亳菊，含總?cè)屏糠謩e為滁菊＞亳菊＞杭菊＞貢菊，為菊花具有抗炎降壓等功效提供了理論依據(jù)。杭菊中總黃酮含量相對較高，具有較大的開發(fā)應(yīng)用前景。

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