周曼，曹唯儀，王玉蓉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

葡萄籽主要含有多酚類物質(zhì)(GPS)，包括兒茶素類和原花青素類。其中兒茶素類包括兒茶素、表兒茶素及其沒食子酸酯，是葡萄籽中主要的單聚體，也是原花青素寡聚體和多聚體的構(gòu)成單位，在植物體內(nèi)經(jīng)生物化學(xué)反應(yīng)而形成復(fù)雜的聚合物［1］，是一種強(qiáng)抗氧化劑，其抗氧化功效是維生素C的20倍、維生素E的50倍;具有抗氧化及清除自由基、抗輻射、抗腫瘤、抗衰老、治療心血管疾病、提高免疫功能、預(yù)防神經(jīng)退行性改變等作用［2－4］。本文采用正交試驗(yàn)方法，以兒茶素為指標(biāo)，篩選葡萄籽中多酚類有效部分的提取工藝，考察葡萄籽的最佳提取工藝參數(shù)。

1 儀器與試藥

RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);B－220型恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);紫外可見分光光度計(上海先科分光儀器有限公司);BSIIOS型電子分析天平(北京市賽多利斯儀器系列有限公司);G16型醫(yī)用高速離心機(jī)(安新白洋離心廠)。

兒茶素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110877－201102);葡萄籽(購自河北安國藥材市場，經(jīng)本校陳玉婷教授鑒定為正品);香草醛、甲醇、濃鹽酸(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法的建立

2.1.1 對照品儲備液的制備 取105℃干燥至恒重的兒茶素對照品，精密稱定20.18mg，置50mL量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取葡萄籽粗粉1.029 4g，置100mL圓底燒瓶中，加60%乙醇溶液50mL，水浴回流提取2次，每次30min，濾過，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇，水相轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，定容［5］。取上述溶液4mL，離心30min(16 000r/min)，取上清液，備用。

2.1.3 吸收波長的選擇 精密吸取對照品溶液和供試品溶液各0.5mL，置10mL比色管中(避光)，加入3.0mL 4%香草醛甲醇溶液和1.5mL濃鹽酸，混勻，室溫放置顯色15min［6］。以純水為空白，在200～800nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，對照品溶液和供試品溶液均在500nm處有最大吸收峰，確定吸收波長為500nm，見圖1。

圖1 對照品溶液和供試品溶液吸收波長掃描圖

2.1.4 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密移取對照品儲 備 液 1.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、7.0mL、8.0mL，置10mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度。分別移取上述不同濃度對照品溶液各0.5mL，置10mL比色管中(避光)，加入3.0mL 4%香草醛甲醇溶液和1.5mL濃鹽酸，混勻，室溫放置顯色15min。以純水為空白，照紫外－可見分光光度法，在500nm處測定吸光度(A)。以兒茶素濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1.773X+0.000 1，r=0.999 8。結(jié)果顯示，兒茶素對照品在0.038 1～0.304 8mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 不同提取條件對多酚提取效果的影響

2.2.1 乙醇濃度對多酚提取效果的影響 準(zhǔn)確稱取葡萄籽粗粉5份，分別置于100mL圓底燒瓶中，依次加入8BV 20%、40%、60%、80%、95%的乙醇溶液，回流提取2次，每次30min，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮回收乙醇，水相用蒸餾水定容至100mL，搖勻，備用。精密量取2.0mL樣品溶液，置10mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得各乙醇濃度項下供試品溶液。取供試品溶液4mL，離心30min(16 000r/min)，吸取上清液0.5mL，置10mL比色管中(避光)，照兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下的方法，測定樣品溶液的吸光度，計算多酚得率。結(jié)果顯示，40%、60%乙醇多酚得率較高，見圖2。

圖2 乙醇濃度對多酚提取效果的影響

2.2.2 溶劑倍量對多酚提取效果的影響 考察6BV、8BV、10BV、12BV及14BV溶劑倍量對多酚提取效果的影響，其余操作同2.2.1。結(jié)果顯示，10BV乙醇較為適宜，見圖3。

圖3 溶劑倍量對多酚提取效果的影響

2.2.3 提取時間對多酚提取效果的影響 考察提取時間 30、60、90、120、150min 對多酚提取效果的影響，結(jié)果顯示，1.5h多酚得率可達(dá)90%以上，見圖4。

圖4 提取時間對多酚提取效果的影響

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)選 L9(34)正交試驗(yàn)方法考察乙醇濃度(A)、提取次數(shù)(B)和提取時間(C)，10BV提取溶劑，以多酚含量為指標(biāo)，并計算提取物干膏得率。結(jié)果見表1～3。

表1 L9(34)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)與結(jié)果

表3 方差分析表

方差分析結(jié)果顯示，B因素有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，各因素對得率的影響次序?yàn)?B＞C＞A。A1B3C3為最佳提取方案，即10倍量50%乙醇，提取3次，每次2h。但是考慮到提取時間過長對多酚類成分的穩(wěn)定性會有影響，擬對總提取時間做調(diào)整。

2.4 時間對比試驗(yàn) 以多酚類物質(zhì)得率為指標(biāo)，測定藥材中多酚類成分的含量，驗(yàn)證優(yōu)化工藝參數(shù)的可行性，結(jié)果見表4。

表4 時間對比試驗(yàn) (n=3)

結(jié)果顯示，提取時間延長，含量無顯著性差異。綜合考慮工業(yè)成本、提取效率，用10倍量50%乙醇，提取3次，第1次2h，第2次1h，第3次1h，藥材中多酚含量為2.31%，出膏率為7.11%。

3 討論

葡萄籽中的含量測定方法主要有香草醛－鹽酸比色法和鐵鹽催化比色法，但鐵鹽催化比色法對樣品中含水量要求苛刻，顯色溫度較高，時間較長。因此，選擇操作簡便的香草醛－鹽酸比色法。

通過單因素考察，分別比較了乙醇濃度、溶劑倍量、提取時間對提取多酚類成分工藝的影響，為正交試驗(yàn)提供合理可靠的考察因素和水平。通過正交試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)選出A1B3C3，即10倍量50%乙醇，提取3次，每次2h，并對總提取時間做了調(diào)整。通過對比試驗(yàn)，得出提取時間延長，對含量無顯著性影響。綜合考慮工業(yè)成本、提取效率，最終確定用10倍量50%乙醇，提取3次，提取4h。

［1］ 劉向榮，鄧銀華.葡萄籽多酚性成分對小鼠抗氧化作用研究［J］.中國藥學(xué)雜志，2010，45(11):835 －837.

［2］ 左媛，王曉聞.葡萄籽提取物研究進(jìn)展綜述［J］.山西科技，2010，25(3):138－139.

［3］ 楊立軍.葡萄多酚的研究概況［J］.海峽藥學(xué)，2009，21(6):103－105.

［4］ 高軍濤，HuiruTang，侯京武，等.葡萄籽中多酚類物質(zhì)對氧自由基清除作用的 ESR 研究［J］.波譜學(xué)雜志，1999，16(5):409－415.

［5］ 向陽，馬龍，蘇德奇.比色法測定葡萄皮和葡萄籽中的含量［J］.中國公共衛(wèi)生，2003，19(10):1228 －1229.

［6］ 王光亞.保健食品功效成分檢測方法［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2002:159－160.