李竹英，王雪慧，劉建秋

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

急性肺損傷(ALI)以細(xì)胞因子大量釋放為特征的全身過度炎癥反應(yīng)為發(fā)病基礎(chǔ)，發(fā)病機制復(fù)雜，其中，促炎因子及炎癥介質(zhì)引發(fā)的級聯(lián)效應(yīng)為近年來研究的熱點之一［1］。核轉(zhuǎn)錄因子κB作為炎性因子級聯(lián)效應(yīng)的中心因子，在ALI疾病過程中受LPS刺激下被激活，為ALI發(fā)病過程中的特異性因子，本研究將系統(tǒng)觀察急性肺損傷大鼠模型肺組織中NF－κB p65的表達(dá)，證明LPS信號傳導(dǎo)通路激活NF－κB，進(jìn)一步探討中藥通腑湯對NF－κB的作用，闡述通腑湯對本病的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物 Wistar清潔級大鼠60只，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院實驗動物中心，體質(zhì)量(230±20)g。實驗大鼠飼養(yǎng)在23℃，黑夜和白晝各12h的環(huán)境中，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后用于實驗。手術(shù)前禁食12h，但不禁水。

1.2 主要試劑及藥物

凍干精制大腸肝菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS);通腑湯:主要藥物(大黃、枳實、厚樸、杏仁、黃芩、甘草);地塞米松;4%甲醛、石蠟、乙醇、蘇木精、伊紅;濃縮型DAB試劑盒及PV6001二步法免疫組化試劑盒等。

2 實驗方法

2.1 分組，動物模型的建立，給藥方法 參考已發(fā)表文獻(xiàn)［2－3］。

2.2 標(biāo)本的采集及相關(guān)指標(biāo)檢測 于給藥后第2h，用5%戊巴比妥鈉20mg/kg對大鼠進(jìn)行麻醉，取右肺中葉組織固定于4%多聚甲醛中，用于免疫組化檢測NF－κB，并采用免疫組化(PV二步法)檢測(嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作)，用美國Universal Imaging Porporation專用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行處理，在每個時間點選取3張，每張切片隨機選取5個視野，用Meta Morph軟件對陽性細(xì)胞的光密度進(jìn)行分析。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0進(jìn)行處理，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

通腑湯對各組大鼠肺組織中NF－κB p65表達(dá)的影響 結(jié)果見表1，圖1～6。

表1 肺組織NF－κB p65表達(dá)圖像分析結(jié)果(±s)

表1 肺組織NF－κB p65表達(dá)圖像分析結(jié)果(±s)

注:與正常組比較，△P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.01;與地塞米松組比較，☆P ＜0.05，★P ＞0.05;與通腑湯低劑量組比較，※P ＜0.05;與通腑湯中劑量組比較，◇P＞0.05。

組別 n 光密度值正常組10 43.53 ±3.78模型組 8 181.96 ±17.57△地塞米松組 9 129.35 ±15.12*通腑湯低劑量組 10 145.85 ±7.81＊☆通腑湯中劑量組 9 131.63 ±12.51＊★※通腑湯高劑量組 10 127.52 ±11.76＊★※◇

4 討論

4.1 通腑湯對ALI大鼠模型NF－κB p65的影響

在靜止細(xì)胞中，NF－κB與其抑制因子在一起形成復(fù)合體，從而以無活性形式存在于細(xì)胞漿。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)毒素刺激后，NF－κB抑制因子即發(fā)生磷酸化和降解，使NF－κB游離并進(jìn)入細(xì)胞核，與目的基因結(jié)合位點結(jié)合，并啟動基因轉(zhuǎn)錄。而活化的NF－κB遷移至核內(nèi)，在核內(nèi)NF－κB核轉(zhuǎn)錄因子又可誘導(dǎo)眾多炎癥相關(guān)的特異基因如TNF，IL－6，IL－8等的表達(dá)。在正常細(xì)胞中，NF－κB以無活性形式存在于細(xì)胞漿，如本實驗中正常組所表現(xiàn)，免疫組化結(jié)果呈弱陽性免疫反應(yīng)，陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物多分布在胞漿中，胞核中極少見或沒有陽性免疫反應(yīng)物質(zhì)，支氣管壁及肺組織僅見少量散在的NF－κB陽性細(xì)胞，主要位于氣道黏膜上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，肺間質(zhì)中幾無NF－κB陽性細(xì)胞表達(dá)(見圖1);模型組與正常組相比，NF－κB p65呈強陽性免疫反應(yīng)(P＜0.05)，陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物不僅分布在陽性細(xì)胞的胞漿中，細(xì)胞核中的陽性蛋白表達(dá)也呈強陽性，并可見明顯的細(xì)胞核易位(見圖2)，表明NF－κB p65已活化，說明 LPS致 ALI后，大鼠肺組織中NF－κB p65蛋白的表達(dá)在受到LPS刺激后被迅速活化，并立即進(jìn)入細(xì)胞核中，與目的基因的啟動子或增強子結(jié)合，誘導(dǎo)了基因的表達(dá)，使炎性細(xì)胞因子增加，參與炎癥的發(fā)生。在治療組中(見圖3～6)，在胞核中陽性反應(yīng)減輕，在胞漿中弱陽性表達(dá)，呈淡棕色，表明地塞米松及通腑湯均可下調(diào)NF－κB基因轉(zhuǎn)錄從而抑制NF－κB p65蛋白水平的表達(dá)，其中，以高、中劑量組下調(diào)明顯，與地塞米松組相當(dāng)，而低劑量組則不及上三組。

既往研究發(fā)現(xiàn)，ALI中存在著明顯的NF－κB激活［4］，本實驗也證實了這一點，從而證實了NF－κB的異常激活參與了急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展過程。NF－κB通過誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，引起炎癥反應(yīng)失控，導(dǎo)致組織損傷，參與ALI發(fā)生。通腑湯及地塞米松均可以減少NF－κB p65的激活，降低NF－κB p65的蛋白表達(dá)，從而減輕ALI早期炎癥反應(yīng)失控，減輕組織器官損傷，達(dá)到對ALI的保護(hù)作用。

4.2 通腑湯方藥分析

通腑湯是依據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，以通腑除滿、清肺平喘為法而組方的純中藥制劑。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病的主要病機為腸阻肺壅。當(dāng)邪熱入陽明，腑實熱結(jié)，腑氣不通，致痞滿燥實形成，濁氣不能下趨，反上逆于肺，致肺氣不利，肺失宣降，故見喘促、氣粗、肺氣郁閉，宣降失常，則津停成痰，或致痰熱阻肺，熱毒壅盛而灼傷肺絡(luò)。方中大黃味苦性寒，即能瀉下攻積，又能清熱瀉火，且在方中用量最大，故為君藥。積滯內(nèi)阻，致使腑氣不通，故用枳實辛行苦降，即能破氣除痞以治氣滯，又能消積導(dǎo)滯以助大黃攻下，為臣藥。厚樸辛以行氣，消腑氣不通之脹滿;苦以降氣，助大黃推陳出新之功;且厚樸能燥濕化痰，下氣平喘，針對肺氣不降之咳喘有降氣之功，亦為臣藥。杏仁降氣平喘，以助厚樸;肺主宣發(fā)肅降，其性有開有合，杏仁味苦能降，兼有疏利開通之性，降肺氣之中兼有宣肺之功，以順應(yīng)肺性;且杏仁有潤腸通便之效，以助大黃，為佐藥之用。肺為嬌臟，肺中有熱以致肺不能宣發(fā)肅降而出現(xiàn)咳喘，故用黃芩清肺熱以止咳喘，亦為佐藥。方中藥物寒溫不和，故用甘草調(diào)和藥性，為使藥之用，全方共奏通腑瀉熱，降氣平喘之功。

圖1 正常對照組肺組織NF－κBp65蛋白表達(dá)(200×)

圖2 模型組肺組織NF－κBp65蛋白表達(dá)(200×)

圖3 地塞米松組肺組織NF－κBp65蛋白表達(dá)(200×)

圖4 通腑湯低劑量組肺組織NF－κBp65蛋白表達(dá)(400×)

圖5 通腑湯中劑量組肺組織NF－κBp65蛋白表達(dá)(200×)

圖6 通腑湯高劑量組2肺組織NF－κBp65蛋白表達(dá)(200×)

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn)(草案)［S］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2000，23(4):203.

［2］ 劉曉東.通腑湯對急性肺損傷大鼠肺、腸組織TGF－β1的影響［D］.哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

［3］ 李竹英，劉琳，李傳鈺.通腑湯對急性肺損傷大鼠NF－κB mRNA的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2011，39(6):32 －34.

［4］ 金婧.LPS致新生大鼠急性肺損傷促炎性細(xì)胞因子抗炎性細(xì)胞因子和NF－κB變化及N－乙酰半胱氨酸干預(yù)作用的研究［D］.沈陽:中國醫(yī)科大學(xué)，2004.