劉玉紅， 劉倩伶， 黃志芳， 劉云華， 易進海

(四川省中醫(yī)藥科學院，四川成都610041)

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott．的干燥根莖，川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort．的干燥根莖。石菖蒲芳香走竄、開竅醒神，廣泛用于神昏閉證的治療［1］，臨床療效確切;川芎活血行氣，祛風止痛［2］。二者常相須為用，有協(xié)同增效作用，其主要化學成分為α-細辛醚、藁本內(nèi)酯、欖香烯、甲基丁香酚等脂溶性揮發(fā)成分［3］，均能透過血腦屏障發(fā)揮醒腦開竅作用，對缺血性腦損傷療效確切［4-8］。對腦缺血患者來說，研制一種穩(wěn)定性好，高效、速效的制劑十分必要。根據(jù)石菖蒲、川芎揮發(fā)油親脂性強，親水性差，口服生物利用率低的理化性質(zhì)及作用特點，本研究將其研制成揮發(fā)油亞微乳的鼻腔噴霧劑，以改善藥物吸收和分布特征，提高用藥順應(yīng)性和生物有效性，降低毒副作用及不良反應(yīng)。本實驗分別采用正交試驗、單因素試驗對處方和制備工藝進行優(yōu)化研究，并對其穩(wěn)定性進行了考察。

1 儀器與試藥

NS1001L2k型高壓均質(zhì)機 (意大利 Niro-Soavis．P．A．公司)，IKA高剪切分散乳化機(最高轉(zhuǎn)速30 000 r/min，廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司)，Zetasizer Nano Zen3600粒度儀 (英國馬爾文公司)，恒溫水浴鍋 (北京醫(yī)用儀器設(shè)備廠)、DNP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (北京醫(yī)用設(shè)備廠)。

石菖蒲揮發(fā)油和川芎揮發(fā)油分別由本實驗室采用水蒸氣蒸餾和超臨界二氧化碳提取;注射用蛋黃卵磷脂E-80(德國Lipoid公司)，注射用油酸 (德國Lipoid公司)，泊洛沙姆188(F-68，德國BASF公司)，甘油 (成都科龍化工試劑廠，分析純)，注射用油 (鐵嶺北亞藥用油有限公司)，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 石芎亞微乳處方及制備方法的初步確定 參照脂肪乳注射液的處方［9］，初步確定本品處方為石芎揮發(fā)油100 g/L、大豆油0～100 g/L、磷脂12～18 g/L、泊洛沙姆188為0～12 g/L、油酸5 g/L，甘油22 g/L。

通過預實驗確定本品制備工藝為:將磷脂、甘油、泊洛沙姆188(F-68)，加適量水，高速剪切分散均勻;石芎揮發(fā)油、大豆油、油酸、混合均勻;油相、水相分別水浴加熱至70℃，以5 mL/min的流量往水相中滴加油相，邊滴加邊攪拌，轉(zhuǎn)速20 000 r/min滴加完畢后繼續(xù)攪拌5 min，加水至100 mL，調(diào)節(jié)pH值至9，以85 MPa的壓力高壓乳勻7次，測定 pH值，流通蒸汽滅菌1 h，即得。

2.2 石芎亞微乳的質(zhì)量評價指標及穩(wěn)定性考察

2.2.1 外觀性狀［10］分為四等:一等為微黃白色乳劑，無油滴，靜止時不分層，搖動時不掛壁;二等為微黃白色乳劑，無油滴，靜止時不分層，搖動時液體從內(nèi)壁快速滑落;三等為淡黃色乳劑，靜止時略有分層，表面沒有或略有少量油滴，搖動時液體滑落較慢，有掛壁;四等為淡黃色乳劑，靜止時表面有明顯油滴，有分層，甚或有油水分層。給各等級乳劑打分，分值為M，一等乳M=0，二等乳M=10，三等乳M=20，四等乳M=30。權(quán)重系數(shù)為1。

2.2.2 粒徑 取滅菌后的乳劑50μL至10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，用動態(tài)光散射法，測定其平均粒徑和粒徑分散系數(shù)PDI。粒徑分布均勻，平均粒徑100～300 nm，PDI 0.20以下為0分;粒徑分布較均勻，平均粒徑100～500 nm，有5%以下1～5μm的大粒子，PDI 0.20～0.30得分10;粒徑分布呈多重峰，PDI大于0.30得20分。分值越低，表明乳劑質(zhì)量越好。權(quán)重系數(shù)為1。

2.2.3 離心穩(wěn)定性［11］取滅菌后的乳劑，置10 mL離心試管中，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，精密量取離心后樣品50μL，置10 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度;離心前樣品稀釋相同倍數(shù)后分別于500 nm處測定吸光度 (離心前樣品為A0，離心后樣品為A)。計算穩(wěn)定性常數(shù)K e=│A0—A│/A0，K e值越小，表明乳劑越穩(wěn)定。權(quán)重系數(shù)為100。

2.3 石芎亞微乳的處方優(yōu)化

2.3.1 pH值對乳劑成型的影響 本試驗采用高剪切分散乳化法制備初乳。經(jīng)過預實驗發(fā)現(xiàn)，本品初乳pH值對產(chǎn)品能否成型起到?jīng)Q定性作用，故考察了初乳調(diào)節(jié)pH值方式和pH值對穩(wěn)定性的影響。結(jié)果見表1。

由表1結(jié)果可知，調(diào)節(jié)pH值對本品的成型至關(guān)重要，初乳制備完成后，立即用2%NaOH溶液調(diào)pH9左右，高壓均質(zhì)后pH值下降至8左右，能保持乳劑的穩(wěn)定性。

2.3.2 處方優(yōu)化 根據(jù)初步篩選的處方，采用正交試驗，以外觀得分M、粒徑得分N、離心穩(wěn)定性常數(shù)K e為評價指標，采用綜合評分方法進行評價，綜合評價指標L=M+N+K e×100，對大豆油、乳化劑磷脂、助乳化劑泊洛沙姆188的用量進行篩選。結(jié)果見表2～4。

用方差分析法和直觀分析法對數(shù)據(jù)進行分析可知，各因素對乳劑成型的影響為:C(泊洛沙姆188用量)＞A(大豆油用量) ＞B(磷脂用量)，泊洛沙姆188的用量對乳劑的成型有極顯著影響，以12 g/L為最佳;A因素有顯著影響，以50 g/L為最佳;B因素無顯著影響，根據(jù)極差結(jié)果，磷脂用量選用12 g/L即可。

表1 初乳pH值及調(diào)節(jié)方式對成品的影響Tab．1 Effect of primary emulsion's pH and accommodation way with the end product

表2 因素水平Tab．2 Factors and levels

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab．3 Orthogonal experiments design and the results of the experiments

表4 正交試驗方差分析Tab．4 Results of orthogonal experiments and analysis of variance

2.4 石芎亞微乳的制備工藝優(yōu)化

2.4.1 影響初乳成型的各種因素的篩選 本品初乳采用高剪切分散法制備，影響初乳成型的主要因素有剪切的溫度、剪切的轉(zhuǎn)數(shù)和剪切時間。本研究采用單因素試驗進行考察。

2.4.1.1 剪切溫度的考察 在室溫 (25℃)、70℃、80℃條件下，以20 000 r/min的旋轉(zhuǎn)頻率攪拌10 min，考察初乳的外觀形態(tài)。結(jié)果室溫條件下，油水相分離;70℃、80℃條件下制得初乳外觀為微黃白色均勻，表面無浮油，可行。較高溫度可降低油水相的黏度，使二者更好的融合，有利于初乳的成型?？紤]到本品主藥為揮發(fā)油類成分，含有較多的烯、醚等不飽和成分，易氧化變質(zhì)和揮發(fā)的原因，采用稍低的溫度更為恰當，故選擇70℃為剪切溫度。

2.4.1.2 剪切旋轉(zhuǎn)頻率的考察 在70℃條件下，分別以16 000、20 000、22 000 r/min的旋轉(zhuǎn)頻率攪拌10 min，考察初乳的外觀形態(tài)。結(jié)果16 000 r/min攪拌的初乳外觀為微黃白色乳劑，表面有少量浮油，另兩個樣品外觀均為微黃白色乳劑，表面無浮油，故攪拌旋轉(zhuǎn)頻率以20 000 r/min即可。

2.4.1.3 剪切時間的考察 在70℃條件下，滴加完油相后，以20 000 r/min分別繼續(xù)剪切5、10、15 min，觀察初乳的外觀形態(tài)，結(jié)果3種初乳外觀均為微黃白色均勻乳劑，表面沒有或有極少浮油，故剪切5 min即可。

2.4.2 均質(zhì)壓力和次數(shù)的確定 均質(zhì)壓力一般為50～100 MPa，經(jīng)過多次實驗確定均質(zhì)壓力為80 MPa。又對均質(zhì)次數(shù)進行了考察，每均質(zhì)1次取樣，進行7次均質(zhì)。結(jié)果見圖1。可見隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，粒徑減小，粒徑分布更加均勻，離心穩(wěn)定性增加，均質(zhì)5次后粒徑和粒徑分布變化趨于穩(wěn)定，故均質(zhì)6次即可。

圖1 均質(zhì)次數(shù)對粒徑分布的影響Fig．1 The effect of homogenize times with particle size distribution

2.5 石芎亞微乳的制備 按照擬定的處方和工藝條件，制備石芎揮發(fā)油亞微乳。將磷脂1.2 g、甘油2.2 g、泊洛沙姆188(F-68)1.2 g，加適量水，高速剪切分散均勻;石芎揮發(fā)油10 g、大豆油5 g、油酸0.7 mL、混合均勻;油相、水相分別水浴加熱至70℃，以5 mL/min的流量往水相中滴加油相，邊滴加邊攪拌，旋轉(zhuǎn)頻率20 000 r/min滴加完畢后繼續(xù)剪切5 min，加水至100 mL，調(diào)節(jié)pH值至9，以80MPa的壓力高壓乳勻6次，測定pH值約8.5，蒸汽滅菌1h，即得。

2.6 石芎亞微乳的物理穩(wěn)定性考察 按照擬定的處方和制備工藝，制得石芎亞微乳 (批號:20081224，20090115，20090118)，由于亞微乳是熱力學不穩(wěn)定體系，對熱敏感，故在考察室溫和40℃加速試驗的同時進行 (6±2)℃長期留樣試驗，考察物理穩(wěn)定性的變化。將樣品分別于 (6±2)℃冷藏、室溫和40℃孵箱中放置，對樣品的外觀性狀、粒徑、離心穩(wěn)定性等指標進行考察，試驗結(jié)果見表5。結(jié)果表明本品較為穩(wěn)定。

3 討論

3.1 助乳化劑的選擇 本品單獨采用磷脂為乳化劑時，粒徑分布不均勻，為多重峰，很快有油相析出，單純增加磷脂的用量不能得到改善。非離子表面活性劑泊洛沙姆188(F-68)乳化能力強，可以提高乳化效率，減小乳滴粒徑;同時泊洛沙姆188的曇點較高，熱滅菌的穩(wěn)定性較好。根據(jù)界面膜理論［12］，磷脂可以形成較高的界面電荷，有利于阻止乳滴的聚集，泊洛沙姆188主要是形成空間穩(wěn)定位阻，防止乳滴的合并，兩種類型乳化劑的混合使用，可提高表面膜的強度。

表5 石芎揮發(fā)油亞微乳的穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab．5 Stability experiment results of Shixiong volatile oil subm icron emulsion

3.2 pH值的影響 亞微乳界面上，主要由于磷脂的離解，使乳滴帶有負電荷，帶相同電荷的乳滴互相靠近時，由于電場的排斥作用而難以聚集，提高乳液的穩(wěn)定性［13］。卵磷脂中某些磷脂的離解與體系pH值密切相關(guān)，在酸性條件下，磷脂易發(fā)生水解，不穩(wěn)定。乳劑的pH值會影響ζ電勢，進而影響亞微乳系統(tǒng)的穩(wěn)定性。石芎揮發(fā)油中含有較多的烯醇、醚、酮等類化學成分，會降低體系的pH值，不調(diào)節(jié)pH值不能成型。初乳調(diào)pH9以后高壓均質(zhì)，成型性良好，各項指標優(yōu)良，體系ζ電位值－26.5 mV。

3.3 油相的用量 油相用量過高或過低，都會影響乳劑的成型，本試驗也驗證了這一結(jié)果，大豆油的用量以50 g/L為最佳，不加或多加，都會影響本品的成型。

［1］張立田．石菖蒲對中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用研究［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2007，9(3):141．

［2］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:38．

［3］周明哲，王嗣岑，陳 湘．石菖蒲水蒸氣蒸餾提取物和超臨界提取物的GC-MS分析［J］．藥物分析雜志，2010，30(2):11-15．

［4］王 聰，劉 勇，王 曙．川芎超臨界萃取物及其乙醇提取物的藥理作用比較［J］．華西藥學雜志，2009，24(3):250-252．

［5］凌 婧，鄧文龍，張 杰，等．川芎油對腦缺血再灌注損傷大鼠的保護作用［J］．中藥藥理與臨床，2008，24(1):39-41．

［6］柯雪紅，方永奇．石菖蒲揮發(fā)油對腦缺血-再灌注腦中氨基酸的影響［J］．中國老年學雜志，2003，23(5):302-303.

［7］方永奇，魏 剛，柯雪紅．GC-MS分析石菖蒲揮發(fā)油透大鼠血腦屏障的成分研究［J］．中藥新藥與臨床藥理，2002，13(2):181-182．

［8］張 旭，江秀龍，陳興泳，等．丹參川芎嗪治療急性腦梗死及對血清IL-6、MMP9水平的影響［J］．福建醫(yī)科大學學報，2010，44(4):276-279．

［9］中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準第六分冊［S］．1998:117．

［10］周 俊，逄秀娟，彭 煒，等．茴拉西坦亞微乳處方及制備工藝考察［J］．沈陽藥科大學學報，2008，25(9):684-689．

［11］馮明芳，趙春順，武瑞凌，等．3-正丁基苯酞靜脈注射亞微乳的制備和穩(wěn)定性考察［J］．沈陽藥科大學學報，2008，25(4):262-268．

［12］奚念朱．藥劑學［M］．3版．北京:人民衛(wèi)生出版社，1994:104-105．

［13］陳 偉．細辛腦亞微乳及其鼻腔噴霧系統(tǒng)的研究［D］．北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學，2006．