馮彬彬， 張建海， 李金玲， 徐曉玉*

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120;2.西南大學(xué)，重慶 400716)

內(nèi)異消是本課題組研制開發(fā)的用于治療子宮內(nèi)膜異位癥的中藥新藥，由川芎、當(dāng)歸、延胡索等藥材組成。川芎嗪 (tetramethylpyrazine，TMPZ)是川芎中的一種活性生物堿成分，可以改善微循環(huán)，并對心血管疾病有著顯著的療效［1］;阿魏酸 (ferulic acid，F(xiàn)A)是當(dāng)歸、川芎中的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)靜、抑制血小板聚集及抗血栓形成等作用［2］;延胡索乙素 (Tetrahydropalmatine，TET)是中藥延胡索中所含具有鎮(zhèn)痛作用的有效成分［1］。對川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素單一成分的HPLC的測定有較多報道［3-9］，但是采用HPLC法同時測定性質(zhì)差別較大的川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素尚無報道。本實(shí)驗(yàn)建立了同時測定川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的RP-HPLC法，為內(nèi)異消的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料、儀器和藥品

1.1 儀器和藥品 美國Agilent1200(智能柱溫箱;MWV紫外檢測器);H1650—W臺式微量高速離心機(jī) (長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);EL—204電子天平 ［梅特勒-托利多儀器 (上海)有限公司］;WH—2微型渦旋混合儀 (上海滬西分析儀器廠);Millipore純水系統(tǒng)。甲醇為色譜純(購自迪馬公司);冰醋酸為分析純;水為去離子水;阿魏酸對照品 (批號:110773-200611)、川芎嗪對照品 (批號:110817-200305)、延胡索乙素對照品 (批號:110726-200610)(均購自中國藥品生物制品檢定所);香豆素對照品 (購自Sigma公司);阿魏酸原料藥、川芎嗪原料藥、延胡索乙素原料藥 (購自南京澤朗有限責(zé)任公司，純度均在95%以上)。

1.2 動物 SD大鼠，清潔級，雌性，體質(zhì)量為 (220±20)g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號:SCXK(渝)2007-0001。

2 方法和結(jié)果

2.1 對照溶液的配制 取川芎嗪對照品15 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，得川芎嗪貯備液質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL;同樣方法配制阿魏酸貯備液質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，延胡索乙素貯備液質(zhì)量濃度為0.66 mg/mL;香豆素貯備液質(zhì)量濃度為0.73 mg/mL，將上述香豆素貯備液稀釋至13.687 5μg/mL。

2.2 色譜條件 Agilent SB-C18ODS色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5μm);流動相為甲醇-0.3%冰醋酸 (42∶58);體積流量1.0 mL/min;檢測波長280 nm;溫度30℃。

2.3 生物樣品預(yù)處理和測定方法專屬性考察 精密吸取大鼠血漿樣品100μL，加150μL內(nèi)標(biāo)和150μL甲醇，渦旋震蕩2 min，沉淀蛋白，10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22μm微孔濾膜，取10μL進(jìn)樣，并按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。按上述血漿樣品處理方法處理空白血漿加內(nèi)標(biāo)、川芎嗪對照溶液、阿魏酸對照溶液、延胡索乙素對照溶液加內(nèi)標(biāo)及灌胃內(nèi)異消制劑的大鼠血漿樣品加內(nèi)標(biāo)，分別繪制HPLC色譜圖(見圖1)。

圖1 川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的專屬性考察色譜圖

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:在2.2項(xiàng)色譜條件下，川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素與內(nèi)標(biāo) (香豆素)及血液內(nèi)源物質(zhì)色譜峰分離良好，無明顯干擾峰出現(xiàn)，血漿中雜質(zhì)對藥物質(zhì)量濃度的測定無干擾。說明本色譜條件可行。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密吸取8份大鼠空白血漿各100μL，分別精密加入50μL不同質(zhì)量濃度的川芎嗪對照溶液、50μL不同質(zhì)量濃度的阿魏酸對照溶液、50μL不同質(zhì)量濃度的延胡索乙素對照溶液和上述相同質(zhì)量濃度的香豆素內(nèi)標(biāo)150μL，制成含川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素各成分分別為0.035 1、0.140 6、0.562 5、1.057 0、2.109 6、4.219 0、8.438 0、16.875 0 μg/mL;0.032 2、0.128 8、0.515 0、1.030 0、2.060 0、4.120 0、8.240 0、16.480 0 μg/mL 和 0.016 1、0.064 6、0.258 3、0.516 5、1.033 3、2.065 0、4.130 0、8.250 0μg/mL的系列質(zhì)量濃度，按照2.3項(xiàng)進(jìn)行處理和測定，分別以川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素和內(nèi)標(biāo)的峰面積之比與川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素質(zhì)量濃度做回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到復(fù)方藥物各成分的回歸方程，川芎嗪為:y=0.031 8x+0.014，r=0.999 6;阿魏酸為:y=0.640 5x－0.068 6，r=0.999 8;延胡索乙素為:y=0.149 1x+0.018 6，r=0.999 5。結(jié)果表明，川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素分別在0.035 1～16.875 0、0.032 2～16.480 0μg/mL和0.016 1～8.250μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取大鼠空白血漿100μL，分別加入低、中、高不同質(zhì)量濃度的川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液各50μL，再加入150μL相同質(zhì)量濃度香豆素溶液，每個質(zhì)量濃度平行3份，配制成川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素質(zhì)量濃度分別為2.109 6、4.219 0、8.475 0 μg/mL;2.060 0、4.120 0、8.480 0 μg/mL 和 1.133 0、3.854 0、6.780 0μg/mL的3個質(zhì)量濃度，按2.3項(xiàng)生物樣品預(yù)處理方法處理，每份樣品平行進(jìn)樣3次，代入各自標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算川芎嗪、阿魏酸、延胡索乙素在血漿中的質(zhì)量濃度，并計(jì)算加樣回收率。計(jì)算結(jié)果見表1。

由表1可以看出川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素平均回收率均在80%～120%之間，RSD均小于10%，表明該方法加樣回收率符合生物樣品要求。

2.6 精密度試驗(yàn) 樣品配制同2.5項(xiàng)下方法，每份樣品平行進(jìn)樣5次，各以1 d內(nèi)測得的各物質(zhì)濃度計(jì)算日內(nèi)精密度，以1周內(nèi)3次配制測定的各物質(zhì)計(jì)算日間精密度。計(jì)算各成分含有量，結(jié)果見表2～表4。

表1 川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的加樣回收率 (±s，n=3)

表1 川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的加樣回收率 (±s，n=3)

川芎嗪/(μg·mL－1)平均回收率/%RSD/% 阿魏酸/(μg·mL－1)平均回收率/%RSD/% 延胡索乙素/(μg·mL－1)平均回收率/% RSD/%2.109 6 108.80±0.06 5.85 2.06 113.46±0.07 6.191.133 97.78±0.04 4.05 4.219 104.22±0.06 5.34 4.12 110.43±0.01 0.60 3.854 97.34±0.03 3.36 8.475 96.66±0.02 1.86 8.48 98.77±0.01 1.30 6.780 99.88±0.01 1.39

表2 川芎嗪精密度 (±s，n=5)

表2 川芎嗪精密度 (±s，n=5)

質(zhì)量濃度/(μg·mL－1)日內(nèi)日間樣品平均質(zhì)量濃度/(μg·mL－1) RSD/% 樣品平均質(zhì)量濃度/(μg·mL－1) RSD/%2.109 6 2.707 8±0.122 8 4.53 2.800 2±0.358 4 12.8 5.645 6.126 6±0.403 8 6.59 5.744 2±0.395 8 6.89 8.475 8.358 0±0.286 4 3.43 8.451 8±0.280 4 3.32

表3 阿魏酸精密度 (±s，n=5)

表3 阿魏酸精密度 (±s，n=5)

質(zhì)量濃度/(μg·mL－1)日內(nèi)日間樣品平均質(zhì)量濃度/(μg·mL－1) RSD/% 樣品平均質(zhì)量濃度/(μg·mL－1) RSD/%2.06 2.570 7±0.209 4 8.15 2.527 5±0.192 8 7.63 5.65 5.413 7±0.175 1 3.24 5.074 6±0.072 2 1.42 8.48 8.360 7±0.186 7 2.23 8.329 7±0.283 2 3.40

表4 延胡索乙素精密度 (±s，n=5)

表4 延胡索乙素精密度 (±s，n=5)

質(zhì)量濃度/(μg·mL－1)日內(nèi)日間樣品平均質(zhì)量濃度/(μg·mL－1) RSD/% 樣品平均質(zhì)量濃度/(μg·mL－1) RSD/%1.13 1.374 2±0.074 6 5.43 1.364 4±0.068 8 5.04 3.35 3.558 5±0.351 5 9.88 3.180 0±0.294 6 9.26 5.12 5.287 0±0.245 2 4.64 5.105 3±0.307 6 6.02

由表2、3、4可以看出川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素低質(zhì)量濃度精密度RSD均小于20%，中、高質(zhì)量濃度精密度RSD均小于15%，表明精密度良好，符合生物樣品精密度要求。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取空白血漿100μL，分別加入2.1項(xiàng)下各物質(zhì)中質(zhì)量濃度對照溶液，配制成含川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素分別為4.219 0、4.120 0和3.854 0μg/mL質(zhì)量濃度的生物樣品，按照2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，分別于0、2、4、6、8、10、12 h取樣測定，求得川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素含有量的RSD分別為5.8%、3.4%、4.5%，表明該液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

3.1 中藥復(fù)方進(jìn)入體內(nèi)之后，成分為多成分，所以要確定體內(nèi)成分含有量須建立體內(nèi)多成分的測定方法。目前對于川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素3種成分同時測定尚無報道，本實(shí)驗(yàn)建立了3種有效成分的同時測定方法，效果令人滿意。

3.2 本實(shí)驗(yàn)選擇相同波長下3種物質(zhì)的同時測定，采用1種物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，且流動相選擇了常用的甲醇和冰醋酸，省時、省力、高效、降低成本。本方法既可在常規(guī)HPLC條件下單獨(dú)測定川芎嗪、阿魏酸和延胡索乙素的血藥濃度，亦可用于同時測定3種成分。

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