陳華英，李秀芳，金若敏，符勝光，姚廣濤

（上海中醫(yī)藥大學藥物安全評價研究中心，上海 201203）

主動全身過敏試驗 (Active Systemic Anaphylaxis，ASA)是考察注射劑Ⅰ型過敏反應要求進行的試驗項目之一。《藥物研究技術指導原則》(以下簡稱“指導原則”)中推薦ASA的實驗動物一般選用豚鼠，近年來發(fā)現(xiàn)臨床前中藥注射劑安全性評價過敏反應的高陰性率與臨床出現(xiàn)較多過敏反應的結果有不一致的現(xiàn)象，促使思考如何提高臨床前過敏性試驗的靈敏度。有學者建議在進行中藥注射劑犬長期毒性試驗時密切關注相關的致敏反應出現(xiàn)情況，摸索能充分反映注射劑安全性的評價方法［1］。目前也有文獻報道豚鼠對某些中藥藥源性的致敏原敏感性較差［2］。

近年來，在進行食品、蛋白質(zhì)等的致敏性評價以及過敏癥動物模型 (如哮喘、過敏性休克等)的研究時常采用大鼠作為實驗對象［3-12］。這就提示在對中藥注射劑的致敏性研究的主動全身過敏試驗中，如果能篩選出敏感性較高的大鼠品系作為ASA的實驗動物，對于提高中藥注射劑臨床前致敏性潛力預測將具有重要的現(xiàn)實意義。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，不同品系大鼠與過敏相關的一些細胞因子及免疫球蛋白水平在未致敏狀態(tài)時已存在較大差異，鑒于此，課題組采用了 BN、F344、SD、Wistar 4種品系大鼠，以常用的陽性藥卵白蛋白 (Ovalbumin，OVA)和天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)作為受試物，進行了不同品系大鼠ASA的研究。同時對清開靈注射液和注射用燈盞花素進行了豚鼠和4種品系大鼠的主動全身過敏試驗。

1 材料

1.1 動物 Hartley豚鼠，清潔級，雌性，體質(zhì)量300～340 g，購于上海生物制品研究所，許可證編號:SCXK(滬)2004-0003；BN、F344、 SD、Wistar大鼠，SPF級，雌雄各半，160～180 g，由上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供，許可證編號:Scxk(滬)2008－0016。動物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心，SPF級環(huán)境。

1.2 藥物 卵白蛋白，Sigma產(chǎn)品，購于北京鼎國生物技術有限責任公司，批號:DHO15-4；天花粉蛋白 (1.2 mg/mL，1 mL/支)，上海金山制藥有限公司生產(chǎn)，批號: 070901；清開靈注射液 (10 mL/支)，由某制藥廠生產(chǎn)，批號:711901A；注射用燈盞花素 (50 mg/支)，由某藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號:20080905。

2 方法

2.1 卵白蛋白、天花粉蛋白對動物的主動全身過敏試驗［1］

2.1.1 給藥劑量 根據(jù)“指導原則”規(guī)定:陽性對照組給予1～5 mg/只卵白蛋白或已知致敏陽性物質(zhì)，激發(fā)劑量一般為致敏劑量的2～5倍量［1］。本實驗在前期試驗的基礎上選擇卵白蛋白的致敏劑量5 mg/只，天花粉蛋白致敏劑量0.6 mg/kg，激發(fā)劑量分別為致敏劑量的2倍。臨用前用生理鹽水配制。

2.1.2 致敏 分別取 Hartley豚鼠，BN、F344、SD、Wistar大鼠，按體質(zhì)量隨機分為陰性對照組、卵白蛋白組、天花粉蛋白組，每組6～10只。分別腹腔注射致敏劑量的卵白蛋白和天花粉蛋白，隔日1次，連續(xù)3次。陰性對照組注射等容量生理鹽水。

2.1.3 激發(fā) 在末次致敏后第14天，動物靜脈注射進行激發(fā)，各組激發(fā)劑量為致敏劑量的2倍，靜脈快速注射。觀察豚鼠注射后即刻至30 min內(nèi)的過敏反應情況，并對動物過敏反應發(fā)生強度進行判斷。豚鼠全身致敏性評價標準［1］為:“－”，過敏反應陰性 (癥狀:正常)；“+”，過敏反應弱陽性(癥狀:躁動、豎毛、顫抖、搔鼻)；“++”，過敏反應陽性 (癥狀:噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞、流淚)； “+++”，過敏反應強陽性(癥狀:呼吸困難、哮鳴音、紫癜、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、喘息、痙攣、旋轉、潮式呼吸)；“++++”，過敏反應極強陽性 (癥狀:死亡)。計算過敏反應發(fā)生率，根據(jù)過敏反應發(fā)生率和發(fā)生程度進行綜合判斷。大鼠在激發(fā)后，除了參照豚鼠過敏反應癥狀表觀察外，還應觀察比較給藥組與陰性對照組大鼠反應的不同。

2.1.4 補充試驗 激發(fā)注射后，若發(fā)現(xiàn)有過敏反應癥狀時，取健康未致敏動物2只，自靜脈快速注射激發(fā)劑量的受試物，觀察受試物是否會引起的類似過敏反應癥狀，供結果判斷時參考。

2.2 清開靈注射液、注射用燈盞花素的主動全身過敏試驗［1］

2.2.1 給藥劑量 卵白蛋白的致敏劑量及激發(fā)劑量同2.1.1項；清開靈注射液的致敏劑量為2.5 mL/kg；注射用燈盞花素:豚鼠的致敏劑量為62.5 mg/kg，大鼠的致敏劑量為25 mg/kg，激發(fā)劑量均為致敏劑量的2倍。

2.2.2 致敏 分別取 Hartley豚鼠，BN、F344、SD、Wistar大鼠，按體質(zhì)量隨機分為陰性對照組、卵白蛋白組、清開靈注射液組、注射用燈盞花素組，每組6～8只。腹腔注射致敏，陰性對照組給予等容量生理鹽水，隔日1次，共3次。

2.2.3 激發(fā) 末次致敏后第14天，動物靜脈注射進行激發(fā)，各組激發(fā)劑量為致敏劑量的2倍。同2.1.3項，觀察豚鼠注射后即刻至30 min內(nèi)的過敏反應情況，并對動物過敏反應發(fā)生強度進行判斷，計算過敏反應發(fā)生率，根據(jù)過敏反應發(fā)生率和發(fā)生程度進行綜合判斷。大鼠在激發(fā)后，除了參照豚鼠過敏反應癥狀觀察外，還應觀察比較給藥組與陰性對照組大鼠反應的不同。

2.2.4 補充試驗 同2.1.4項。

3 統(tǒng)計學方法

實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，過敏反應發(fā)生率采用卡方檢驗，過敏反應發(fā)生程度采用秩和檢驗。

4 結果

4.1 卵白蛋白、天花粉蛋白的主動全身過敏試驗

4.1.1 過敏反應癥狀、發(fā)生率、發(fā)生程度 結果顯示，豚鼠對卵白蛋白和天花粉蛋白的主動全身過敏反應癥狀以呼吸困難，步態(tài)不穩(wěn)、紫癜，痙攣，潮式呼吸為主，偶見搔鼻、咳嗽癥狀；大鼠對卵白蛋白和天花粉蛋白的主動全身過敏反應癥狀以呼吸急促或呼吸困難、步態(tài)不穩(wěn)、紫疳、四肢軟癱、活動減少為主，偶見喘息、痙攣。4種品系大鼠對卵白蛋白和天花粉蛋白所致主動全身過敏的陽性反應癥狀比較一致，且與豚鼠的癥狀大致相近。見表1。在試驗結束后對大鼠進行解剖發(fā)現(xiàn)，不同品系大鼠的胃腸道均有不同程度的充血。

表1 卵白蛋白和天花粉蛋白致Hartley豚鼠和4種品系大鼠主動全身過敏反應癥狀Tab.1 Symptoms of Hartley guinea pig and four rat strains induced by ovalbumin or trichosanthin in ASA test

豚鼠和4種品系大鼠對卵白蛋白和天花粉蛋白過敏反應的發(fā)生率均為100%，與正常組比較，有極顯著差異 (P＜0.01)，4種品系大鼠對卵白蛋白或天花粉蛋白的過敏反應發(fā)生率與豚鼠比較，未見明顯差異。見表2。根據(jù)豚鼠全身致敏性評價標準對卵白蛋白和天花粉蛋白的過敏反應強度進行評價，豚鼠對卵白蛋白均有極強陽性反應；對天花粉蛋白有3只豚鼠產(chǎn)生陽性反應，3只產(chǎn)生極強陽性過敏反應；4種品系大鼠在本研究所使用劑量下，對兩種抗原的主動全身過敏反應強度未見明顯的差異，均表現(xiàn)為強陽性。見表3。

表2 卵白蛋白和天花粉蛋白致Hartley豚鼠和4種品系大鼠主動全身過敏反應發(fā)生率Tab.2 Incidence of allergic response induced by ovalbumin or trichosanthin in Hartley guinea pig and four rat strains

4.1.2 補充實驗 取健康未致敏豚鼠及4種品系大鼠各4只，均分為兩組，分別靜脈注射激發(fā)劑量卵白蛋白和天花粉蛋白，給藥后動物未出現(xiàn)類似過敏反應癥狀。

4.1.3 初步制定大鼠過敏反應癥狀表 以4種品系大鼠對兩種過敏原的過敏反應癥狀為主要基礎見表4、表5，參照豚鼠ASA過敏反應癥狀表對應觀察，將大鼠的陽性反應歸納、匯總分析后，初步制定了大鼠ASA過敏反應癥狀表6。由于本研究中使用的動物樣本數(shù)及受試物種類有限，故對大鼠ASA試驗中過敏反應癥狀評價表的初步制定是在豚鼠ASA癥狀表的基礎上補充了大鼠的活動減少、 四肢軟癱等重要癥狀。

表3 卵白蛋白和天花粉蛋白致Hartley豚鼠和4種品系大鼠主動全身過敏反應程度Tab.3 Degree of allergic response induced by ovalbumin or trichosanthin in Hartley guinea pig and four rat strains

表4 卵白蛋白致4種品系大鼠主動全身過敏反應不同癥狀的發(fā)生率Tab.4 Positive ratio of each symptom induced by onalbumin of four rat strains in ASA test

表5 天花粉蛋白致4種品系大鼠主動全身過敏反應不同癥狀的發(fā)生率Tab.5 Positive ratio of each symptom induced by trichosanthin of four rat strains in ASA test

表6 大鼠過敏反應癥狀Tab.6 Symptoms of rat in ASA test

4.1.4 初步制定大鼠全身致敏性評價標準 將豚鼠與大鼠ASA評價標準及癥狀進行排序?qū)Ρ?，在豚鼠評價標準的基礎上，制定了大鼠全身致敏性評價標準，見表7。

表7 大鼠全身致敏性評價標準Tab.7 Evaluation criteria standard of rat in ASA test

4.2 清開靈注射液、注射用燈盞花素ASA試驗研究

4.2.1 過敏反應癥狀、發(fā)生率、發(fā)生程度 以清開靈注射液攻擊不同種類動物后，動物的表現(xiàn)也稍有不同。Hartley豚鼠過敏癥狀主要為顫抖、偶見雙耳發(fā)紅，BN大鼠出現(xiàn)躁動不安，SD大鼠偶見呼吸急促，F(xiàn)344和Wistar大鼠未見異常反應；注射用燈盞花素攻擊動物后，Hartley豚鼠無明顯過敏反應癥狀，BN大鼠出現(xiàn)躁動不安，F(xiàn)344大鼠出現(xiàn)搔鼻、躁動不安、紫疳的過敏反應癥狀，SD大鼠僅見活動減少，Wistar大鼠未見異常。見表8。在試驗結束后，對動物解剖發(fā)現(xiàn)，清開靈注射液組的SD大鼠見胃腸道輕微充血，注射用燈盞花素組的BN、F344大鼠均見不同程度的胃腸道充血。

表8 清開靈注射液和注射用燈盞花素致Hartley豚鼠和4種品系大鼠過敏反應癥狀Tab.8 Symptoms of Hartley guinea pig and four rat strains induced by Qingkailing Injection or Breviscapine Injection in ASA test

清開靈注射液的過敏反應發(fā)生率從高到低依次為:BN大鼠 (100%)、Hartley豚鼠 (50%)、SD大鼠 (16.67%)、F344和Wistar大鼠 (0)；注射用燈盞花素的過敏反應發(fā)生率從高到低依次為:BN大鼠 (100%)和F344大鼠 (100%)、SD大鼠 (83.33%)、Hartley豚鼠和 Wistar大鼠 (0)。見表9。

表9 清開靈注射液和注射用燈盞花素致Hartley豚鼠和4種品系大鼠過敏反應發(fā)生率Tab.9 Incidence of allergic response induced by Qingkailing Injection or Breviscapine Injection in Hartley guinea pig and four rat strains

根據(jù)豚鼠和大鼠的全身致敏性評價標準，對Hartley豚鼠和4種品系大鼠各組的過敏反應程度進行比較，發(fā)現(xiàn)清開靈注射液激發(fā)后，Hartley豚鼠、BN大鼠出現(xiàn)弱陽性過敏反應，SD大鼠僅有一只出現(xiàn)呼吸急促，判斷為陰性，F(xiàn)344和Wistar大鼠均呈陰性反應；注射用燈盞花素激發(fā)后，F(xiàn)344大鼠出現(xiàn)強陽性過敏反應，BN大鼠過敏反應程度明顯低于F344大鼠，為弱陽性過敏反應，SD大鼠也為弱陽性反應，而Hartley豚鼠和Wistar大鼠均呈陰性反應。見表10。

4.2.2 補充實驗 對動物出現(xiàn)陽性過敏反應的注射劑，取健康未致敏BN大鼠4只，分兩組，分別尾靜脈注射激發(fā)劑量清開靈注射液和注射用燈盞花素，另取健康未致敏F344大鼠2只，尾靜脈注射激發(fā)劑量注射用燈盞花素，給藥后動物均未出現(xiàn)類似過敏反應癥狀。

5 討論

大量資料顯示［13-15］，在中藥注射劑所引發(fā)的不良反應中，以免疫毒性最為常見，變態(tài)反應為其主要毒性特征。在中文科技期刊數(shù)據(jù)庫中1979年—2010年的相關文獻的檢索中發(fā)現(xiàn)，共有50多種已上市的中藥注射劑在臨床使用時有過敏反應的報道。雖然引起中藥注射劑過敏反應的因素很多，如患者的過敏性體質(zhì)，注射劑成分的復雜，原藥材質(zhì)量及生產(chǎn)工藝的不同，注射劑中相關物質(zhì)如鞣質(zhì)等的含有量以及藥物的溶媒等都有可能導致過敏反應。考慮到中藥注射劑上市前均做過過敏性安全評價，這從另一方面提示，現(xiàn)行的過敏反應試驗對于全面評價中藥注射劑的潛在致敏性可能存在一定的不足。

對表10 清開靈注射液和注射用燈盞花素致Hartley豚鼠和4種品系大鼠過敏反應發(fā)生程度Tab.10 Degree of allergic response induced by Qinghailing Injection or Breviscapine Injection in Hartley guinea pig and four rat strains

目前， “指導原則”中推薦ASA試驗的動物“通常選用體質(zhì)量為300～400 g的豚鼠”。但有文獻報道，豚鼠模型在評價中藥注射劑過敏反應中敏感性較差，郭姍姍等［16-17］用豚鼠和BN大鼠分別評價了雙黃連注射液和清開靈注射液的過敏性，在ASA試驗中，BN大鼠各組過敏反應發(fā)生率均等于或高于豚鼠各組。Li Zhonggang等［18-19］使用BN大鼠評價了不同劑量雙黃連注射液的致敏性，并對其機制進行了初步研究，認為BN大鼠較好的模擬了雙黃連注射液的過敏反應，是一個理想的動物模型。目前國內(nèi)外關于大鼠用于ASA的報道越來越多。

為了進一步考察大鼠用于ASA試驗的可行性，從以下幾個方面進行了探討。

首先，關于大鼠是否可以用于主動全身過敏試驗:本實驗研究結果顯示，在較大劑量時，4種品系大鼠對兩種陽性藥的過敏反應癥狀、過敏反應發(fā)生率基本一致，品系間未見明顯差異，且與豚鼠相近，而過敏反應發(fā)生程度4種品系大鼠間也基本一致，但略弱于豚鼠，未出現(xiàn)極強陽性的反應死亡。從陽性藥定性的角度分析，初步認為大鼠也可以作為ASA的實驗動物。

關于大鼠與豚鼠對致敏原敏感性的分析:陽性藥劑量較大時，4種品系大鼠與豚鼠用于主動全身過敏試驗時，過敏反應發(fā)生率和發(fā)生程度未見明顯區(qū)別；在同樣致敏和激發(fā)條件下的清開靈注射液，BN大鼠的過敏反應發(fā)生率高于豚鼠，BN大鼠和豚鼠過敏反應發(fā)生程度沒有顯著差異；對于注射用燈盞花素，豚鼠用大于大鼠的劑量，實驗結果呈陰性，而BN、F344、SD大鼠則出現(xiàn)過敏反應。

其次，大鼠的不同品系對預測中藥注射劑潛在致敏性的影響:課題組從動物遺傳背景、T細胞尤其是輔助性T細胞1與輔助性T細胞2(Th1/Th2)細胞因子分布格局［20］、國內(nèi)易得和前期研究結果等方面綜合考慮，挑選了兩個近交系大鼠 BN、F344和兩個封閉群大鼠 SD、Wistar。結果顯示，對于清開靈注射液，4種品系大鼠的過敏反應發(fā)生率從高到低依次為:BN大鼠＞SD大鼠＞F344、Wistar大鼠；對于注射用燈盞花素，過敏反應發(fā)生率為F344、BN大鼠＞SD大鼠＞W(wǎng)istar大鼠，而且F344大鼠對注射用燈盞花素表現(xiàn)出了強陽性反應，發(fā)生程度顯著高于其余3個品系大鼠。以上結果顯示，不同中藥注射劑對不同品系動物的敏感性存在差異，因此在選用大鼠評價中藥注射劑的潛在致敏性時，應注意大鼠的品系。

本研究對結果判斷中著重注意了對類過敏的排除:凡是在藥物激發(fā)注射后，動物出現(xiàn)過敏反應癥狀時，均按“指導原則”推薦的方法，進行了補充試驗，排除了由于受試物作用引起的類似過敏反應癥狀。

本實驗為大鼠用于主動全身過敏試驗評價中藥注射劑提供了實驗依據(jù)。研究初步提示，不同品系大鼠對不同中藥注射劑潛在致敏能力的敏感性不同，可能與中藥注射劑的復雜體系有關。對此我們將優(yōu)化試驗設計，增加更多的中藥注射劑，進一步深入研究不同品系大鼠對注射劑敏感性不同的現(xiàn)象。

綜合分析，主動全身過敏試驗中補充大鼠作為實驗動物能進一步提高對中藥注射劑過敏反應評價的靈敏性與全面性，有助于更全面的預測藥物潛在的致敏性。

［1］國家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物研究技術指導原則［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2005.

［2］黃芳華.從中藥注射劑的不良反應淺析中藥注射劑研發(fā)中的若干問題［J］.世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2004，6(3):9-14.

［3］Guo P，Piao X，Cao Y，et al.Recombinant soybean protein betaconglycinin alpha'-subunit expression and induced hypersensitivity reaction in rats［J］.Int Arch Allergy Immunol，2008，145(2):102-110.

［4］Akiyama H，Teshima R，Sakushima J I，et al.Examination of oral sensitization with ovalbumin in Brown Norway rats and three strains of mice［J］.Immunol Lett，2001，78(1):1-5.

［5］Dewachter P，Raeth-Fries I，Jouan-Hureaux V，et al.A comparison of epinephrine only，arginine vasopressin only，and epinephrine followed by arginine vasopressin on the survival rate in a rat model of anaphylactic shock［J］.Anesthesiology，2007，106(5):977-983.

［6］Shishehbor F，Behroo L，Ghafouriyan Broujerdnia M，et al.Quercetin effectively quells peanut-induced anaphylactic reactions in the peanut sensitized rats［J］.Iran J Allergy Asthma Immunol，2010，9(1):27-34.

［7］Macedo S M，Vaz S C，Lourenco E L，et al.In vivo hydroquinone exposure impairs allergic lung inflammation in rats［J］.Toxicology，2007，241(1-2):47-57.

［8］Jia Y，Xu L，Heisler S，et al.Airways of a hyperresponsive rat strain show decreased relaxant responses to sodium nitroprusside［J］.Am J Physiol，1995，269(1 Pt 1):85-91.

［9］Skripuletz T，Schmiedl A，Schade J，et al.Dose-dependent recruitment of CD25+and CD26+T cells in a novel F344 rat model of asthma［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2007，292(6):1564-1571.

［10］Singh P，Daniels M，Winsett D W.et al.Phenotypic comparison of allergic airway responses to house dust mite in three rat strains［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2003，284(4):588-598.

［11］劉 婷，梁愛華，易 艷，等.BN大鼠與豚鼠用于藥物致敏性評價的比較［J］.中國中藥雜志，2009，34(4):472-475.

［12］李中港，秦慧迪，汪懷山，等.BN大鼠與Wistar大鼠Ⅰ型超敏反應敏感性的比較［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2010，24(1):30-34.

［13］邱水生，嚴國鴻.常見中藥注射劑不良反應表現(xiàn)及原因探析［J］.海峽藥學，2007，19(9):114-116.

［14］丁玉峰.中藥注射劑引起的變態(tài)反應及其影響因素［J］.華中醫(yī)學雜志，2007，31(4):244-246.

［15］黃小萍.中藥注射劑不良反應54例臨床分析［J］.臨床誤診誤治，2008，21(1):87-88.

［16］郭姍姍，王意忠，張 毅，等.BN大鼠和豚鼠評價雙黃連注射液的過敏反應［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2009，23(2):128-133.

［17］郭姍姍，王意忠，張 毅，等.BN大鼠和豚鼠對清開靈注射液致速發(fā)型過敏反應的比較［J］.藥學學報，2009，44(8):852-857.

［18］Li Zhonggang，Gao Yan，Wang Huaishan，et al.A rat model of Shuang Huang Lian injection-induced anaphylaxis［J］.Asian Pac J Allergy Immunol，2010，28:185-191.

［19］李中港.過敏反應動物模型的建立及在雙黃連注射劑過敏反應檢測中的應用［D］.濟南:山東大學，2010.

［20］Gillespie K M，Saoudi A，Kuhn J，et al.Th1/Th2 cytokine gene expression after mercuric chloride in susceptible and resistant rat strains［J］.Eur J Immunol，1996，26(10):2388-2392.