任秀梅，趙彥斌，孫兆增，許 琴，白杰英，劉 一，胡仲明，靳 朝，曾 林

(1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071;3.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動物實驗科，烏魯木齊 830000)

比格犬一種新雌激素β受體可變剪切體的克隆及鑒定

任秀梅1，2，趙彥斌2，孫兆增2，許 琴3，白杰英2，劉 一2，胡仲明2，靳 朝1，曾 林2

(1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長春 130062;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071;3.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院動物實驗科，烏魯木齊 830000)

目的 對比格犬雌激素β受體的新剪切體進行克隆與鑒定。方法 以比格犬垂體組織為模板，用RT-PCR方法從垂體組織中擴增雌激素β受體，電泳確定新剪切體的存在情況.并對其進行克隆和序列測定.結(jié)果 利用設(shè)計的引物得到2條明顯電泳條帶，通過測序表明其中一種為新的可變剪切體，目前此可變剪切體尚未見報道。結(jié)論 得到了雌激素β受體的一種新的可變剪切體，有助于研究雌激素β受體可變剪切體的功能及其在生殖調(diào)控過程中的作用。

比格犬;雌激素受體β;基因克隆;可變剪切體

近幾年，對比格犬生殖調(diào)控機理和技術(shù)的研究已成為國內(nèi)外的熱點研究問題之一，哺乳動物的雌激素調(diào)節(jié)著生殖系統(tǒng)的發(fā)育以及調(diào)控發(fā)情周期［1］。雌激素通過雌激素受體發(fā)揮其生物學(xué)作用，在大多數(shù)的哺乳動物體內(nèi)都存在ERα和ERβ兩種雌激素受體，并且每種受體都有多種剪切異構(gòu)體，除野生型ERβ外，人還存在六種、小鼠有兩種、大鼠有三種ERβ剪切異構(gòu)體，不同動物ERβ的剪切異構(gòu)體千差萬別，并且這些不同剪切異構(gòu)體的功能也不盡相同。目前通過對小鼠、大鼠和人的不同ERβ剪切異構(gòu)體結(jié)構(gòu)和功能的研究，在動物生殖調(diào)控方面取得了長足進步，特別是在生殖系統(tǒng)腫瘤方面［2］。但目前對比格犬的ERβ及其剪切異構(gòu)體的研究報道卻相當(dāng)匱乏，因此本實驗擬通過克隆比格犬雌激素β受體基因，明確比格犬雌激素β受體可變剪接體的存在情況，為進一步明確雌激素β受體在生殖調(diào)控過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:

Trizol(Invitrogen);DEPC(Promega);反轉(zhuǎn)錄試劑盒 ReverTra Ace(TOYOBO);pMD18-T載體(TaKaRa);標準分子量核酸 DNA Marker2000購自康為世紀公司;凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自杭州BioFlux公司。

1.1.2 菌種:大腸菌株TOP10感受態(tài)細胞購自博邁德生物公司。

1.1.3 實驗動物:比格犬4只，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供(實驗動物合格證號［SCXK-(軍)2002-001］)，實驗動物使用合格證號［SYXK-(軍)2007-005］。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計:根據(jù)NCBI中比格犬ERβ轉(zhuǎn)錄本24(XM_861041.2)的mRNA序列設(shè)計一對引物，上游為 5'-ATGGATATCAAAAACTCTCC-3'，下游為5'-AGTGTCTCTCTGTTTACAG-3'，擴增片段長度為371 bp。引物送往生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2 比格犬垂體組織總RNA的制備:取4只比格犬垂體組織約100 mg用于總RNA的提取:利用液氮與研磨器將樣品研磨成粉末狀，將粉末轉(zhuǎn)移到DEPC處理過的1.5mL的離心管中，加入1mL的Trizol，然后按照試劑說明書提供的方法抽提總RNA。抽提的總 RNA取2.0 μL測定 A260/A280值分析純度，同時進行1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA的完整性。

1.2.3 RT-PCR:按TOYOBO cDNA合成試劑盒提供的方法進行cDNA合成和PCR擴增，用逆轉(zhuǎn)錄酶兩步法合成cDNA第一條鏈，然后進行PCR，PCR擴增體積為 25 μL，體系如下:cDNA 1.0 μL，Premix LA Taq 12.5 μL，Sense primer(10 pmol/μL)1.0 μL，Antisense primer(10 pmol/μL)1.0 μL，Distilled H2O 9.5 μL。

PCR(降落PCR)反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃ 變性 30 s，65℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，20 個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低1℃;95℃變性30 s，45℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，20 個循環(huán);最后 72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 雌激素β受體cDNA片段的克隆及DNA序列測定:PCR大量擴增目的基因后，1%凝膠電泳回收純化PCR產(chǎn)物，采用BioFlux公司的膠回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物的回收，將目的基因連接到pMD18-T上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，用藍白篩選和菌液PCR法篩選及鑒定陽性重組子。在陽性重組子中隨機挑選5個陽性克隆分別制備成甘油菌，送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。測序后，應(yīng)用 NCBI BLAST及 DNA MAN對測序結(jié)果進行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 比格犬垂體組織總 RNA的制備

按Trizol一步法從4只比格犬垂體組織中提取總 RNA，其 OD260/OD280值分別為 1.95、2.0、2.02、1.98，1%甲醛變性瓊脂糖電泳(如圖1)所示，可清晰見到18s和28s兩條核糖體 RNA條帶，說明所提取的總 RNA無明顯的降解，是比較完整的。

2.2 RT-PCR擴增ERβ cDNA片段及其序列測定

分別以4只比格犬垂體總 RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄。RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2泳道所示，清晰可見2條片段的擴增條帶。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后，連接到pMD18-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，用藍白斑篩選、菌液PCR(如圖3)鑒定陽性重組子，進行測序。

圖1 總RNA的甲醇變性電泳Fig.1 Formaldehyde denaturalized lectrophoresis of total RNA

圖2 雌激素受體β基因的擴增結(jié)果Fig.2 Amplification results of ER-β gene

圖3 菌液PCR電泳圖Fig.3 Electrophoresis of bacteria PCR

圖4 ERβ序列比對Fig.4 The sequence alignment of the ER-β gene

2.3 正常及剪接異構(gòu)體的序列比對

陽性菌液測序后，與 GeneBank中的比格犬ERβ序列比對，結(jié)果如圖4.克隆得到的新異構(gòu)體較已公布序列多57個堿基。

3 討論

其他研究者以及我們前期的研究工作都表明，雌激素在動物的發(fā)情調(diào)控過程中發(fā)揮了重要的作用［3］。對小鼠、大鼠和人等動物的研究結(jié)果表明，雌激素的正負反饋調(diào)節(jié)與其受體在不同組織的表達差異、表達水平和表達時間密切相關(guān)［4］。雌激素受體(ER)有兩種亞型，即 ERα和 ERβ。目前對許多動物ERα的基因結(jié)構(gòu)及功能特點了解比較多，但對ERβ的了解相對較少，尤其對比格犬的 ERβ的研究則更少。本實驗旨在克隆ERβ基因，明確ERβ在下丘腦-垂體-性腺軸的存在情況。實驗結(jié)果顯示ERβ基因PCR擴增結(jié)果電泳條帶不單一，有兩條帶，原因可能為非特異性擴增，也可能是ERβ基因存在剪切異構(gòu)體，根據(jù)大鼠、小鼠及人的相關(guān) ERβ剪切異構(gòu)體的研究發(fā)現(xiàn)，ERβ存在多種剪切異構(gòu)體，所以我們以為擴增產(chǎn)物不單一的主要原因是比格犬ERβ基因可能存在剪切異構(gòu)體，孔德強等［5］的研究結(jié)果證實了比格犬ERβ基因存在剪切異構(gòu)體，經(jīng)過驗證目的帶之外的電泳條帶證實其為一種新的剪切異構(gòu)體，但由于本實驗只選了ERβ基因部分區(qū)段擴增，要想得到剪切體完整信息還有待進一步深入研究，為其在生殖活動中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

［1］Kutzler MA.Induction and synchronization of estrus in dogs［J］.Theriogenology，2005，64:766－775.

［2］Kobayashi M，Ishii H，Sakuma Y.Identification of novel splicing events and post-transcriptional regulation of human estrogen receptor α Fisoforms［J］.Mol Cell Endocrinol，2011，333(1):55－61.

［3］孫兆增，曾林等.乙烯雌酚對間情期比格犬發(fā)情的誘導(dǎo)［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18(11):36－38.

［4］Springwald A，Lattrich C，Skrzypczak M，Goerse R，Ortmann O，Treeck O.Identification of novel transcript variants of estrogen receptorα， β and progesterone receptor gene in human endometrium［J］.Endocrine，2010，37(3):415－24.

［5］孔德強，胡仲明等.一種比格犬雌二醇β受體剪切異構(gòu)體的克隆和序列分析［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，7(11):44－47.

Cloning and Identification of a New Alternatively Spliced Variants of Beagles Estrogen Receptor β

REN Xiu-mei1，2，ZHAO Yan-bin2，SUN Zhao-zeng2，XU Qin3，BAI Jie-ying2，LIU Yi2，HU Zhong-ming2，JIN Zhao1，ZENG Lin2
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun 130062，China;2.Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Science，Beijing 100071，China;3.Department of Laboratory Animals，Urumqi General Hospital，Lanzhou Military Districts，Urumqi 830000，China)

Objective To clone and identify alternatively spliced variants of beagles estrogen receptor β.Methods By RT-PCR analysis，we identified the existence of a new splice variant of beagles estrogen receptor β using Beagles pituitary organization as a template，to determine the existence of a new spliced variant by electrophoresis and cloned and sequenced.Results Using primers designed to get two obvious electrophoresis with sequencing showed that one of the missing splicing，this alternatively spliced variants has not been reported.Conclusion We get a new estrogen receptor β，this will help to study protein-coding function of a variety of estrogen receptor variable spliced and the role in the process of reproductive regulation.

Beagles;Estrogen receptor β;Cloning;Alternatively spliced variants

Q95-331;R332

A

1671-7856(2012)07-0036-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.007.010

2012-07-05

國家自然科學(xué)基金資助項目(31172164);十二五重大專項“高致病病源動物模型研究(2012ZX10004502)。

共同第一作者:任秀梅(1987－)，女，碩士生;研究方向:寵物醫(yī)學(xué);趙彥斌(1984－)，男，博士生;研究方向:實驗動物學(xué)，E-mail:nmzhaoyanbin@126.com。

曾林(1965－)，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向:實驗動物科學(xué)與管理，E-mail:zenglin1965@126.com;靳朝(1961－)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:寵物醫(yī)學(xué)，E-mail:dwyy2008@163.com。