肖曉光，孫國華，李 巖

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧大連 116011)

整合子系統(tǒng)在非發(fā)酵菌屬細菌中分布特點

肖曉光，孫國華，李 巖

(大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧大連 116011)

［目的］了解整合子系統(tǒng)在非發(fā)酵菌屬細菌中的分布特點，繼而探討其與非發(fā)酵菌產生多重耐藥之間的關系。［方法］選取2010年7月—2011年6月由大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院住院及門診患者各種標本中分離的銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥霍爾德氏菌、木糖產堿桿菌木糖亞種，提取全基因組DNA，通過PCR方法檢測其整合子的攜帶情況，并對擴增結果進行分析。［結果］在452株銅綠假單胞菌中，I類整合子陽性檢出率為41.8%;在612株鮑曼不動桿菌中I類整合子陽性檢出率為66.7%，II類整合子陽性檢出率為2.3%;在61株嗜麥芽窄食單胞菌中I類整合子陽性檢出率為13.1%;在36株洋蔥霍爾德氏菌中，I類整合子陽性檢出率為8.3%;21株木糖產堿桿菌木糖亞種中未檢出整合子;在以上各菌株中均沒有檢測到III類整合子。整合子陽性菌株和整合子陰性菌株的抗菌藥物敏感性試驗結果對比發(fā)現(xiàn)，整合子陽性的菌株對多種抗生素耐藥率均高于整合子陰性菌株。［結論］整合子系統(tǒng)在非發(fā)酵菌屬的某些菌種中檢出率很高，它的存在是非發(fā)酵菌產生多重耐藥的一個重要因素。

非發(fā)酵菌;多重耐藥;整合子;PCR

非發(fā)酵菌屬細菌是院內感染的重要病原菌。近年來，抗生素的廣泛和不限制應用，導致非發(fā)酵菌屬細菌的感染日趨增多，且耐藥性日益嚴重，給臨床治療帶來很大困難。近年來，非發(fā)酵菌屬細菌的多重耐藥性問題已逐步引起了全球范圍的關注，耐藥菌株的快速出現(xiàn)與細菌抗生素耐藥基因的獲得和播散密切相關［1］。目前研究發(fā)現(xiàn)，細菌產生耐藥性的主要方式為細菌之間基因的水平傳遞，從而從環(huán)境中獲得耐藥基因，并已證實了整合子是耐藥基因儲存和轉移的重要結構，因此對整合子的臨床監(jiān)測是十分必要的［2］。

非發(fā)酵菌屬細菌是臨床上分離陽性率較高的致病菌，且常呈多重耐藥的特點，給臨床抗感染治療帶來了很大的困難。因此，本研究對臨床分離出的非發(fā)酵菌屬細菌的整合子系統(tǒng)進行檢測，并對其藥敏結果進行分析，探討整合子系統(tǒng)在非發(fā)酵菌屬細菌的分布特點。

1 材料和方法

1.1 標本來源

2010年7月—2011年6月大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院住院及門診患者各種標本中分離所得452株銅綠假單胞菌、612株鮑曼不動桿菌、61株嗜麥芽窄食單胞菌、36株洋蔥霍爾德氏菌和21株木糖產堿桿菌木糖亞種，無重復株。

陰性對照菌株:標準銅綠假單胞菌菌株(ATCC27853)，由大連市臨床檢驗中心提供。整合子I、II、III型陽性菌株:由衛(wèi)生部北京醫(yī)院提供。

1.2 標本的處理及保存

實驗室對標本的采集和處理均按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行。所有實驗菌株均于-40℃保存。

1.3 試劑和儀器

1.3.1 試 劑:MH 瓊脂、美洛培南(MEM，10 μg)紙片、米諾環(huán)素(MH，10 μg)紙片均為英國OXOID公司產品。

細菌DNA提取試劑盒(MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0)由大連寶生物公司提供。

整合子I、II、III型保守區(qū)基因擴增試劑盒為大連寶生物公司合成。

引物序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.3.2 儀器:全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)WalkAway96由美國德靈公司生產。

全自動數(shù)碼凝膠圖像分析儀Tanon-3500由上海天能科技有限公司生產。

基因擴增儀system9700由美國ABI公司生產。

1.4 方 法

1.4.1 非發(fā)酵菌屬細菌的鑒定及藥敏分析:通過全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)WalkAway96，對菌株進行鑒定和進行藥敏分析。

通過K-B紙片法對美洛培南和米諾環(huán)素補充藥物敏感性試驗。

1.4.2 整合子系統(tǒng)的檢測:細菌DNA的提取:挑取單個菌落于1.5 mL生理鹽水中，35℃孵育過夜。離心棄上清，使用由大連寶生物工程有限公司提供的細菌提取試劑盒(MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0)進行細菌基因組 DNA 的小量純化，按照說明進行操作。

PCR擴增:PCR反應體系為:Premix Taq 25 μL，DNA 模板 3 μL，20 μmol/L 引物各 2 μL，滅菌蒸餾水 20 μL，共 50 μL。擴增條件:94℃ 5 min，然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共 30 個循環(huán)。72℃ 10 min。

電泳:配置0.8%瓊脂糖凝膠電泳，5 V/cm，電泳30 min。使用全自動數(shù)碼凝膠圖像分析儀Tanon-3500觀察電泳結果。

1.5 統(tǒng)計學方法

通過χ2檢驗對各組間差異性進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各類非發(fā)酵菌屬細菌臨床分布情況

臨床分離出2192株革蘭氏陰性桿菌，各類非發(fā)酵菌屬細菌臨床分布情況見表2。

表2 非發(fā)酵菌屬細菌的臨床分布Tab 2 Clinical distribution of Nonfermenters(n=2192)

2.2 整合子PCR擴增陽性結果

整合子PCR擴增陽性結果見圖1、2。

圖1 整合子I PCR擴增陽性結果Fig 1 PCR positive result of int I

圖2 整合子II PCR擴增陽性結果Fig 2 PCR positive result of int II

2.3 各類非發(fā)酵菌屬細菌中整合子分布情況

非發(fā)酵菌中I類整合子的檢出率由高到低依次為:鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌和洋蔥霍爾德氏菌;II類整合子只在鮑曼不動桿菌中檢出;在木糖產堿桿菌木糖亞種中沒有檢出整合子陽性菌株。見表3。

2.4 鮑曼不動桿菌整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥率分析

I、II類整合子陽性的鮑曼不動桿菌對頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、妥布霉素、左氧氟沙星、美洛培南、阿米卡星、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢曲松、慶大霉素、替卡西林/棒酸的耐藥率明顯高于陰性組，兩者比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。見表4。

表3 各類非發(fā)酵菌屬細菌中整合子檢測陽性菌株分布Tab 3 Distribution of Nonfermenters integron positive species

2.5 銅綠假單胞菌整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥率分析

I類整合子陽性的銅綠假單胞菌對美諾培南、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、亞胺培南、妥布霉素、左氧氟沙星的耐藥率明顯高于陰性組，兩者比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。見表5。

2.6 嗜麥芽窄食單胞菌整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥率分析

I類整合子陽性的嗜麥芽窄食單胞菌對復方新諾明、替卡西林/棒酸、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率明顯高于陰性組，兩者比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。見表 6。

2.7 洋蔥伯克霍爾德菌整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥率分析

I類整合子陽性的洋蔥伯克霍爾德菌對頭孢他啶、左氧氟沙星、復方新諾明、替卡西林/棒酸、頭孢哌酮/舒巴坦均有較高的耐藥率，I類整合子陰性的洋蔥伯克霍爾德菌只對左氧氟沙星有較高耐藥率。見表7。

表4 鮑曼不動桿菌整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥率分析Tab 4 Antibiotic resistant rate of Acinetobacter baumannii

表5 銅綠假單胞菌整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥率分析Tab 5 Antibiotic resistant rate of Pseudomonas aeruginosa

表6 嗜麥芽窄食單胞菌整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥率分析Tab 6 Antibiotic resistant rate of Stenotrophomonas

表7 洋蔥伯克霍爾德菌整合子陽性菌株和陰性菌株的耐藥率分析Tab 7 Antibiotic resistant rate of Bukholdeia cepacia

3 討論

非發(fā)酵菌屬細菌多為條件致病菌，但可引起多種臨床感染［3］。目前，非發(fā)酵菌屬中的鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌已成為重要的臨床分離菌株，是引起院內感染的重要病原菌［4］。本研究中鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌在革蘭氏陰性桿菌中的檢出率分別為27.9%和20.6%，已經(jīng)成為大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院重要的臨床分離菌。

整合子是細菌的DNA片段，是一種通過轉座子或接合性質粒將多種耐藥性在細菌中水平傳播的耐藥基因［5］。整合子存在于許多細菌中，在抗生素發(fā)現(xiàn)和應用前即已存在，是細菌的固有結構，在抗生素廣泛應用條件下，整合子可捕獲耐藥基因，具有使耐藥性在細菌之間傳播的功能。根據(jù)整合酶基因的同源性將整合子分為3型。I型整合子在革蘭陰性細菌中分布最廣、檢出最多［6］。I類整合子主要存在于銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、不動桿菌等菌屬中，而Ⅱ類整合子主要存在于志賀菌屬、埃希菌屬、變形桿菌屬、沙門菌屬，不動桿菌屬中也有發(fā)現(xiàn)。Ⅲ類整合子是在黏質沙雷菌的質粒上發(fā)現(xiàn)的，目前在銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌等革蘭陰性菌中也有分離［7］。

本研究中，對本院內常見的5種非發(fā)酵菌屬細菌中整合子的存在情況進行研究，結果顯示，在5種非發(fā)酵菌檢測中4種檢出整合子的存在，其中I類整合子的檢出由高到低依次為:鮑曼不動桿菌408株(66.7%)、銅綠假單胞菌 189 株(41.8%)、嗜麥芽窄食單胞菌8株(13.1%)和洋蔥霍爾德氏菌3株(8.3%);II類整合子只在612株鮑曼不動桿菌中檢出14株占2.3%;在木糖產堿桿菌木糖亞種中沒有檢出整合子陽性菌株。表明目前在本院，整合子陽性菌株在非發(fā)酵菌屬細菌中已普遍存在。

在對于整合子陰性和陽性菌株的藥物敏感性實驗結果的分析中可以看出:整合子陽性的鮑曼不動桿菌對妥布霉素、阿米卡星、慶大霉素的耐藥率明顯高于陰性組(P＜0.05)，說明整合子陽性的鮑曼不動桿菌的可變區(qū)可能攜帶有aacA4-atB8-aadA1基因盒，目前研究發(fā)現(xiàn)該基因盒也是東北部地區(qū)常見的整合子陽性的鮑曼不動桿菌常帶有的基因盒［8］。其中aacA4編碼6'-N-氨基糖苷乙酰轉移酶，而aadA1編碼的氨基糖苷轉移酶，它們是引起鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類耐藥的主要原因。

整合子陽性的銅綠假單胞則可能帶有編碼3-內酰胺酶，耐碳青霉烯類、氨基糖苷類、耐喹諾酮類的多種基因盒［9-10］，因此整合子陽性的銅綠假單胞菌對美諾培南、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星、亞胺培南、妥布霉素、左氧氟沙星的耐藥率明顯高于陰性組(P＜0.05)。

整合子陽性的嗜麥芽窄食單胞菌攜常帶有sul-1/sul-2 基因盒［11］，這是引起嗜麥芽窄食單胞菌對復方新諾明耐藥的主要原因，也與本研究結果相符。

整合子陽性的洋蔥伯克霍爾德菌對頭孢他啶、左氧氟沙星、復方新諾明、替卡西林/棒酸均有較高的耐藥率，但是對于整合子陽性的洋蔥伯克霍爾德菌報道較少，所攜帶的基因盒尚有待于進一步研究，這也是今后主要的研究方向。

本研究還發(fā)現(xiàn)，對于本院整合子陽性的鮑曼不動桿菌，米諾環(huán)素和頭孢哌酮/舒巴坦具有較低的耐藥率;整合子陽性的銅綠假單胞菌中，頭孢哌酮/舒巴坦和阿米卡星具有較低的耐藥率;整合子陽性的嗜麥芽窄食單胞菌中，左氧氟沙星、頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素具有較低耐藥率，整合子陽性的洋蔥伯克霍爾德菌中，頭孢哌酮/舒巴坦和米諾環(huán)素具有較低耐藥率。說明這些藥物可作為因多重耐藥引起治療失敗的非發(fā)酵菌感染中作為首選藥物進行治療。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，對于頭孢他啶在非發(fā)酵菌中耐藥率明顯高于其它同類抗生素，其原因可能是臨床對于頭孢他啶的使用較多，引起耐藥菌株的產生，臨床因盡量減少該抗生素的使用。

本研究結果提示整合子系統(tǒng)的存在是非發(fā)酵菌屬細菌產生耐藥，乃至多重耐藥和泛耐藥的主要原因，這與其它報道基本一致［7］。檢測基因盒-整合子系統(tǒng)能快速準確獲得細菌多重耐藥的信息，為闡明細菌耐藥機制指明了方向，提供了新思路，也向臨床治療多重耐藥菌提出了嚴峻挑戰(zhàn)。只有慎用抗生素，才能有效避免細菌多重耐藥性的發(fā)生［8-9］。

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Integron system distribution characteristic in nonfermenters

XIAO Xiao-guang，SUN Guo-hua，LI Yan
(Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To investigate the integron system distribution characteristic in nonfermenters species.［Methods］Select Multiple resistance species in Pseudomonas aeruginosa，Acinetobacter baumannii，Stenotrophomonas，Bukholdeia cepacia and Subsp xylosoxidans，which were separated from clinical from July 2010 to June 2011，and extracted their DNA，using polymerase chain reaction(PCR)method to amplify the integron and their variable zones，then analysis the result.［Results］In 452 species of pseudomonas aeruginosa，the positive rate of int I was 41.8%;In 612 species of Acinetobacter baumannii，the positive rate of int I was 66.7%;the positive rate of int I was 2.3%;In 61 species of Stenotrophomonas，the positive rate of int I was 13.1%;In 36 species of Bukholdeia cepacia，the positive rate of int I was 8.3%;we did not find int I positive species in Subsp xylosoxidans;we did not detect int III in all species.Through the susceptibility test result between the integron system positive species and the integron system negative species，we find that the resistance rate in integron system positive species are all more than in integron system negative species.［Conclusion］Resistance mediated by integron system was extensively existed in clinical isolates bacteria.It is one of the most important reasons in Multiple resistance of Nonfermenters.

Key words:nonfermenters;multiple resistance;integron;PCR

R466.1

A

1671-7295(2012)05-0487-05

遼寧省教育廳高等學?？蒲许椖?L2010104)

2011-10-04;

2012-09-03

肖曉光(1971-)女，遼寧大連人，主任技師，碩士研究生。

孫國華，主任技師。E-mail:sgh9977@sina.com