李瑞華，聶大平，何麗敏

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044)

CTX-M-15基因在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌頭孢他啶耐藥株中的檢測(cè)

李瑞華1，聶大平1，何麗敏2

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧大連 116027;2.大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116044)

［目的］了解CTX-M-15基因與大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢他啶耐藥的關(guān)系。［方法］篩選ESBLs陽性且對(duì)頭孢他啶耐藥的菌株為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)頭孢他啶敏感而對(duì)頭孢曲松耐藥的菌株為對(duì)照組。多重PCR方法檢測(cè)CTX-M-14，CTX-M-15基因。［結(jié)果］實(shí)驗(yàn)組CTX-M-15基因檢出率高達(dá)75.9%，單純CTX-M-15基因?yàn)?0.6%，同時(shí)存在CTX-M15、CTX -M -14基因?yàn)?5.2%。而對(duì)照組檢出率分別為:17.7%、5.9%、11.8%。［結(jié)論］CTX-M-15基因是大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢他啶耐藥的主要機(jī)制，建議臨床合理使用抗生素，避免引起流行。

CTX-M-15;頭孢他啶耐藥;大腸埃希菌;肺炎克雷伯菌

CTX-M型ESBLs在中國(guó)流行復(fù)雜，已成為最常見的基因型之一，主要以 CTX-M-14，CTXM -3為主，其次為 CTX -M -9 型等［1-4］。近年來，CTX-M-15型ESBLs在歐洲及澳洲一些國(guó)家流行［5-6］，此型酶表現(xiàn)出明顯的水解頭孢他啶的能力，國(guó)內(nèi)CTX-M-15型酶也陸續(xù)被報(bào)道。本研究檢測(cè)CTX-M-15、CTX-M-14基因，初步了解其在大連地區(qū)耐藥菌中的比例及細(xì)菌耐藥性。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

實(shí)驗(yàn)組:收集大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、部分大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及大連市中心醫(yī)院2011年4月—2011年11月期間分離的產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌且對(duì)頭孢他啶耐藥菌株共170株，其中大腸埃希菌94株，肺炎克雷伯菌76株;標(biāo)本主要來源于尿液、痰液、血液、膽汁、分泌物等。對(duì)照組:同時(shí)期分離對(duì)頭孢曲松耐藥而對(duì)頭孢他啶敏感的大腸埃希菌18株，肺炎克雷伯菌16株。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株:陰溝腸桿菌ATCC700323;大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 主要儀器及試劑

細(xì)菌鑒定和藥敏及ESBLs判定由VITEK2型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析系統(tǒng)完成，藥敏折點(diǎn)使用CLSI 2011年判定標(biāo)準(zhǔn)。引物由大連寶生物工程有限公司合成;PCR反應(yīng):由天根生化科技有限公司研制的一管便攜式PCRMastermix完成。

1.3 DNA 的提取

煮沸法提取細(xì)菌DNA做為模板。

1.4 PCR 擴(kuò)增

用多重PCR檢測(cè)180株細(xì)菌中的ESBLs酶基因，所用引物見表1。(引物設(shè)計(jì)參見文獻(xiàn)［3］)

表1 CTX-M-14和CTX-M-15基因的引物Tab 1 The primer of CTX-M-14 and CTX-M-15

PCR檢測(cè)ESBLs基因反應(yīng)體系:反應(yīng)體系共25 μL。每條引物各1 μL，模板2 μL。用蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件:預(yù)變性 94℃，5 min。循環(huán):94℃，45 s;55℃，45 s;72℃，1 min;共30 個(gè)循環(huán)。最后延伸72℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、測(cè)序由大連寶生物工程有限公司完成，序列在GeneBank上檢索比對(duì)，確認(rèn)基因型。

PCR產(chǎn)物電泳:2%瓊脂糖50 mL+1 μL溴化乙錠，100 V，穩(wěn)壓電泳20～30 min，最后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照閱讀結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.0，兩組率的比較使用采用 χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳凝膠成像結(jié)果

臨床株5在205 bp處出現(xiàn)條帶，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為CTX-M-14;臨床株6在415 bp處出現(xiàn)條帶，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為CTX-M-15;其他臨床株在205 bp、415 bp均有條帶。見圖1。

2.2 基因型檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組具有水解頭孢他啶活性的CTX-M型ESBLs主要以CTX-M-15為主，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)，對(duì)照組主要以CTXM-14為主。見表2。

2.3 產(chǎn)CTX-M型ESBLs對(duì)各類藥物的耐藥性

產(chǎn)CTX-M型ESBLs細(xì)菌對(duì)多種藥物同時(shí)耐藥，只有少數(shù)藥物顯示較好的活性。例如，頭孢吡肟和氨曲南在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有較大差異。見表3。

圖1 部分?jǐn)y帶CTX-M-14與CTX-M-15型基因菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig 1 Partial electrophoretic result of CTX-M-14 and CTXM-15

表2 CTX-M-15型、CTX-M-14型ESBLs的檢出率Tab 2 The expression rate of CTX-M-14 and CTX-M-15 n(%)

表3 各類藥物的耐藥率比較Tab 3 Comparison of risistance rate (%)

3 討 論

2009年，武學(xué)成等［1］報(bào)道深圳地區(qū)CTX-M型酶以CTX-M-14型為主，其次為CTX-M-15型;高偉等［2］報(bào)道安徽省產(chǎn)CTX-M型酶以CTXM-14型和CTX-M-3型為主，與此同時(shí)卓超等［3］對(duì)廣州地區(qū)產(chǎn)CTX-M型超廣譜β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的研究中發(fā)現(xiàn)CTXM-14和CTX-M-15為最主要的CTX-M型ESBLS的亞型。有學(xué)者對(duì)耐藥機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)CTXM-15、CTX -M -27、CTX -M -16型酶分別是由CTX-M-3、CTX-M-14和CTX-M-9型酶在240位天門冬氨酸→甘氨酸突變而來的［7］，說明突變使新型酶獲得了水解頭孢他啶的能力。甘氨酸由于缺乏相應(yīng)的側(cè)鏈，突變后降低了其對(duì)頭孢他啶的空間阻礙，使酶的Km值降低，催化效能增加［8］，這使得CTX-M-15型酶水解頭孢他啶的能力增加。另外，還有研究顯示β3鏈和Ω環(huán)的控件狀態(tài)及殘基104ASN，237SER和276ARG等也被認(rèn)為與對(duì)頭孢噻肟水解特性有關(guān)［9］。如CTX-M型ESBLs氨基酸序列中第167位脯氨酸位于決定水解活性的Ω環(huán)，所以當(dāng)該處氨基酸殘基發(fā)生突變時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致其分子生物學(xué)特征改變，如脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸，分子間的作用力發(fā)生變化，分子構(gòu)像發(fā)生改變，活性中心空間變大，才對(duì)頭孢他啶的水解率大大增加。由于影響細(xì)菌對(duì)頭孢他啶耐藥因素很多，還需不斷試驗(yàn)研究已獲得更多信息來了解及控制細(xì)菌耐藥。

本實(shí)驗(yàn)顯示具有水解頭孢他啶活性的CTX-M型ESBLs主要以CTX-M-15為主，檢出率高達(dá)75.9%，單產(chǎn)CTX -M -15型酶為40.6%，同時(shí)產(chǎn)CTX-M -15、CTX-M -14為35.2%。這表明，CTX-M-15型ESBLs為目前大連地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌對(duì)頭孢他啶耐藥的主要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果高于卓超等［3］對(duì)廣州地區(qū)研究:CTX-M-15在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌檢出率分別為21.5%和26.1%，應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)分組有關(guān)。另外，本次研究中，檢出4株菌存在CTX-M-15基因，但對(duì)頭孢他啶敏感;而部分僅產(chǎn)CTX-M-14的菌株又表現(xiàn)出明顯水解頭孢他啶的能力，這些有待進(jìn)一步研究。

鑒于CTX-M-15型ESBLs檢出率較高，臨床不宜單獨(dú)使用頭孢他啶治療。從耐藥結(jié)果(表3)可以看出產(chǎn)CTX-M-15型ESBLs較CTX-M-14型ESBLs的耐藥性略高，尤其對(duì)頭孢吡肟和氨曲南的耐藥性，其耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。眾所周知產(chǎn)ESBLs的菌株對(duì)亞胺培南、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢西丁、阿米卡星、氧氟沙星、氨芐西林/舒巴坦較敏感，對(duì)其他抗生素的敏感性均在40%以下。因此亞胺培南是治療CTX-M型ESBLs菌所致感染最有效的藥物，其次為阿米卡星和帕拉西林/他唑巴坦。因而臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果選擇合適的抗生素。

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［1］武學(xué)成，張阮章，盧月均，等.深圳地區(qū)產(chǎn)CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌基因分型研究［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009(3):56-59.

［2］高偉，孫震，殷俊，等.安徽省產(chǎn)CTX-M型超廣譜B-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌的耐藥性與基因型研究［J］.中國(guó)抗生素雜志，2009，34(1):48 -51.

［3］卓超，蘇丹紅，李紅玉，等.廣州地區(qū)產(chǎn)CTX-M型超廣譜β內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的研究［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32(10):1114 -1119.

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CTX-M-15 gene detected in ceftazidime-resistant E.coli and Klebsiella pneumoniae isolates

LI Rui-hua1，NIE Da-ping1，HE Li-min2
(1.Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;2.Laboratory medicine institute，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

Abstract:［Objective］To investigate the relationship of CTX-M -15 gene to ceftazidime resistance of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae.［Methods］CTX -M -15，CTX -M -14 genes in ceftazidime-resistant or susceptible，producing ESBL Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were detected by Multiplex-PCR.［Results］In ceftazidimeresistant Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates，the total positive rate of CTX -M -15 gene was 75.9%，the positive rate of alone CTX -M -15 gene was 40.6%and the rate of co-existence of CTX -M -15，14 genes was 35.2%.In ceftazidime - susceptible Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates they were 17.7%，5.97%and 11.89%respectively.［Conclusion］CTX -M -15 gene is the major mechanism of ceftazidime resistance in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae.

Key words:CTX-M-15;ceftazidime-resistant;Escherichia coli;Klebsiella pneumoniae

R378.21

A

1671-7295(2012)05-0495-04

2012-05-05;

2012-08-15

李瑞華(1972-)，女，遼寧朝陽人，副主任技師，碩士。E-mail:lrhzyp2006@yahoo.com.cn