田嘉銘 楊國棟 饒 娜 安 芳 王書華 (河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

金蓮花是毛茛科植物金蓮花的干燥花及花蕾，有清熱解毒，消腫明目的功效，臨床上主要用于上呼吸道感染、扁桃體炎〔1〕等。金蓮花中主要藥效成分是葒草苷和牡荊苷，具有抗氧化、抗腫瘤〔2，3〕、降壓等作用，金蓮花藥材和其制劑多以測定牡荊苷和葒草苷的含量控制其質(zhì)量〔4〕。藥代動力學(xué)對金蓮花有效成分單體葒草苷與牡荊苷研究指出，在動物體內(nèi)吸收快，分布也快，藥物起效迅速，主要以消除為主，廣泛分布于動物體內(nèi)的各組織，腎臟中濃度最高〔5，6〕。通過本實驗室對金蓮花有效成分單體葒草苷與牡荊苷的藥代動力學(xué)研究以及藥理學(xué)研究表明，金蓮花有效成分單體葒草苷與牡荊苷具有良好的抗氧化作用〔7〕藥物入腎，提高機體細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運能力，提供了一個有力的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 葒草苷和牡荊苷(河北北方學(xué)院實驗中心，經(jīng)1H-NMR和 HPLC鑒定純度 98.9%);D-半乳糖;分析純;Na+-K+-ATP酶測試盒，南京建成生物有限公司(批號:20100920);Ca2+-Mg2-ATP酶測試盒，南京建成生物有限公司(批號:20100920)考馬斯亮藍蛋白試劑盒，南京建成生物有限公司(批號:20100918)。

1.2 動物 昆明種小鼠(河北北方學(xué)院動物中心提供)。

1.3 儀器 U-3900紫外可見分光光度計(日本);ME235S十萬分之一電子天平(日本);DK-8型電熱恒溫水槽(上海精密實驗設(shè)備有限公司);低溫高速離心機(賽多利斯公司);HQ-60型旋渦混合器(北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司)。

1.4 造模方法 采用D-半乳糖致亞急性衰老法，將D-半乳糖10 000mg溶于500ml生理鹽水中，按注射劑量200 mg·kg-1·d-1(即每克體重0.01 ml)給小鼠腹腔注射，正常對照組注射等體積生理鹽水，造模時間為8 w，每天稱重一次，依據(jù)末次稱重的克數(shù)調(diào)整給藥劑量。

1.5 模型驗證 造模第6周和第8周分別選取正常組和造模組大鼠(備用)8只，摘眼球采血，分離血清，測定總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，以驗證小鼠衰老情況。第8周末，造模組小鼠指標(biāo)與正常組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，顯示模型復(fù)制成功。

1.6 給藥方法 葒草苷和牡荊苷溶液的配制:葒草苷和牡荊苷先用N，N-二甲基甲酰胺溶解后，再加吐溫-80助溶，輕輕振蕩使混勻，然后再加入生理鹽水(N，N-二甲基甲酰胺∶吐溫-80∶生理鹽水=1∶1∶20)。各治療組從第9周始每日上午分別灌胃給藥，正常對照組和模型對照組給等體積的生理鹽水。根據(jù)實驗小鼠與人的體表面積比例系數(shù)換算，維生素E組確定給藥劑量是20 mg/kg，葒草苷、牡荊苷高劑量組40 mg/kg，葒草苷、牡荊苷中劑量組20 mg/kg，葒草苷、牡荊苷低劑量組10 mg/kg，每天稱重一次，依據(jù)小鼠末次體重調(diào)整給藥劑量。給藥時間8 w。

1.7 細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運能力的測定

1.7.1 Na+-K+-ATP酶活性的測定 準(zhǔn)確稱取小鼠肝、腦、腎組織重量，按10%重量體積比制成組織勻漿液，再取一定量的勻漿液加99倍的生理鹽水制成0.1%的組織勻漿液0.1 ml，同時用考馬斯亮藍試劑測定組織蛋白。根據(jù)公式計算酶的活性:Na+-K+-ATP酶(U/mgprot)=(測定管吸光度值-對照管吸光度值)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值-空白管吸光度值)×(標(biāo)準(zhǔn)管濃度×稀釋倍數(shù))/勻漿蛋白的含量。

1.7.2 Ca2+-Mg2-ATP酶活性的測定 準(zhǔn)確稱取小鼠肝組織重量，按重量體積比制成10%的勻漿液，再取一定量的勻漿液加99倍的生理鹽水制成0.1%的組織勻漿認(rèn)0.1 ml同時用考馬斯亮藍試劑測定組織蛋白，按公式計算其活性。Ca2+-Mg2+-ATP酶(U/mgprot)=(測定管吸光度值-對照管吸光度值)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值-空白管吸光度值)×(標(biāo)準(zhǔn)管濃度×稀釋倍數(shù))/勻漿蛋白的含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理，結(jié)果用±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰小鼠體內(nèi)Na+-K+-ATP酶活性能力的影響 與模型對照組相比，空白組組織內(nèi)Na+-K+-ATP酶的活性明顯高于模型組(P＜0.01);葒草苷和牡荊苷各治療組的含量明顯升高，與之相比具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，說明小鼠衰老后細(xì)胞膜的Na+-K+-ATP酶活性明顯降低，而各治療組均具有升高其含量的作用，見表1。蓮花中葒草苷和牡荊苷中、低劑量組對組織細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶的影響作用低于維生素E組，與維生素E組相比，葒草苷和牡荊苷中、低劑量組具有顯著性差異(P＜0.05);紅草苷高劑量組與維生素E組相比無顯著性差異。在對組織上Na+-K+-ATP酶的活性影響上，金蓮花中葒草苷中、低劑量組作用明顯高于牡荊苷同等的劑量組。葒草苷中、低劑量組分別與牡荊苷中、低劑量組相比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，葒草苷和牡荊苷高劑量組相比無顯著性差異。

表1 各組不同組織Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性能力(±s，U，n=8)

表1 各組不同組織Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性能力(±s，U，n=8)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與維生素E組比較:3)P＜0.05;與葒草苷中劑量組比較:4)P＜0.05;與葒草苷低劑量組比較:5)P＜0.05

組別 Na+-K+-ATP肝腎腦Ca2+-Mg2+-ATP肝腎腦±0.624 9.832±0.855 11.254±0.793模型組 2.316±0.776 4.891±0.535 5.027±0.961 2.616±0.798 5.891±0.935 6.027±0.861維生素E組 4.124±0.6312) 7.963±0.9722) 9.124±0.5402) 4.124±1.0312) 7.963±0.9721) 10.124±0.9402)葒草苷高劑量組 4.059±0.5271) 7.864±1.3042) 8.659±0.6042) 4.129±1.0122) 7.864±1.3041) 8.659±1.2042)3)葒草苷中劑量組 3.976±0.3232) 7.656±0.5142) 8.427±0.7692) 3.804±0.8231) 7.723±1.0142) 8.427±0.7692葒草苷低劑量組 3.425±0.6691)3) 6.395±0.4321)3) 7.238±0.6341)3) 3.320±0.8692)3) 6.792±1.0052) 7.238±0.934牡荊苷高劑量組 3.613±0.8242) 7.723±0.6672) 8.0214±0.4772) 3.801±0.6242) 7.523±0.8672) 8.596±0.8772)牡荊苷中劑量組 3.091±0.4242)3)4)7.604±0.5862)3)4)7.812±0.5871)3)4)3.491±0.4341)3)4)7.004±0.9862)3)4)8.342±0.9871)3)4)牡荊苷低劑量組 2.865±1.3201)3)5)6.124±0.6951)3)5)6.806±0.7321)3)5)3.004±0.6201)3)5)6.217±0.8951)3)5)7.094±1.8901)3)5)空白組 4.528±0.624 9.236±0.455 10.254±0.793 5.128

2.2 金蓮花中葒草苷和牡荊苷對D-半乳糖致衰小鼠體內(nèi)Ca2+-Mg2-ATP酶活性能力的影響 金蓮花中葒草苷和牡荊苷都具有提高肝、腦、腎組織細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，與模型組相比，空白組組織內(nèi)Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);各治療組的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，說明小鼠衰老后細(xì)胞膜的Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯降低，而各治療組均具有升高其含量的作用，見表1。

金蓮花、葒草苷和牡荊苷中、低劑量組對組織細(xì)胞上的Ca2+-Mg2+-ATP酶的影響作用低于維生素E組;與維生素E組相比，葒草苷和牡荊苷中、低劑量組具有顯著性差異(P＜0.05)，葒草苷和牡荊苷高劑量組與維生素E組相比，無顯著性差異。對組織上Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性影響上葒草苷中、低劑量組作用明顯高于牡荊苷中、低劑量組，葒草苷中、低劑量組分別與牡荊苷中、低劑量組相比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，葒草苷與牡荊苷高劑量組相比無顯著性差異。

3 討論

衰老過程中常伴有Ca2+自然平衡失調(diào)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子的超載，并有可能是神經(jīng)系統(tǒng)的老化動因之一。最近的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的超載與衰老的老年性疾病密切相關(guān)，而Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性是Ca2+分布的基礎(chǔ)，現(xiàn)已作為觀察衰老的新指標(biāo)〔8〕。Na+-K+-ATP酶導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP的生成和鈉離子轉(zhuǎn)運障礙，從而影響細(xì)胞的整體功能。Ca2+-Mg2+-ATP酶可以水解ATP，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，以維持細(xì)胞內(nèi)相對較低的Ca2+濃度，這是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機制之一，也是細(xì)胞得以正常發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。研究表明，自由基的損傷對細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATP酶有抑制作用，自由基可直接氧化ATP酶蛋白氨基酸殘基，使酶失活，ATP酶活性降低可影響神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+的分布，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度大增，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高可使細(xì)胞骨架和膜結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，可激活Ca2+依賴性降解酶，內(nèi)切酶磷脂酶使膜磷脂水解，花生四烯酸釋放增加，同時又產(chǎn)生大量自由基，使膜通透性增大，造成惡性循環(huán)細(xì)胞衰老，是生物體整體衰老的基礎(chǔ)。

本試驗發(fā)現(xiàn)，而金蓮花中有效成分單體中葒草苷與牡荊苷各治療組均具有較好的提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性作用，減少自由基對細(xì)胞膜的損傷，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和Ca2+的穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮抗衰老作用。金蓮花中有效成分單體中葒草苷中、低劑量組對于提高組織細(xì)胞膜上的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性高于牡荊苷同等劑量組，表明葒草苷在提高機體內(nèi)活性比牡荊苷的具有較強的作用。

1 李藥蘭，葉紹明，王凌云，等.長瓣金蓮花中原金蓮酸的分離和生物活性〔J〕.暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2002;23(1):124-6.

2 孫 黎，程建貞，羅 強，等.金蓮花黃酮對 K562、HeLa、Ec-109、NCI-H446細(xì)胞增殖的影響〔J〕.鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2009;44(5):981-3.

3 孫 黎，劉 芳，劉 華，等.金蓮花黃酮對人乳腺癌細(xì)胞作用的研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2010;30(9):1098.

4 黃文哲，王 磊，段金廒.短瓣金蓮花化學(xué)成分的研究〔J〕.中草藥，2001;31(10):731-2.

5 曲彩紅.金蓮花中葒草苷兔體內(nèi)藥代動力學(xué)研究〔D〕.中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，2010.

6 顏 娟.金蓮花中牡荊苷兔體內(nèi)藥代動力學(xué)研究〔D〕.中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，2010.

7 顏 娟，胡海娜，曲彩紅，等.金蓮花總黃酮抗氧化作用的研究〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2010;21(2):386.

8 張 偉，張艷淑，姚 林，等.Oncolyn對衰老小鼠腦組織中ATP酶活性和神經(jīng)生長因子的表達的影響〔J〕.衛(wèi)生研究，2007;36(2):164-6.