趙 欣，李 巖，王 麗 爽，張 宗 申

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引言

金鐵鎖（Psammosilenetunicoides）隸屬石竹科金鐵鎖屬，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、自然繁殖能力差，集中分布在高海拔、溫差小的云南、貴州等西南部地區(qū)，是我國(guó)特有的單種屬植物和傳統(tǒng)的民族藥用植物［1-2］。藥用植物中很多藥用成分都是次生代謝產(chǎn)物，而次生代謝與細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育階段、基因型和外界環(huán)境因素等都有很大關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，分布于細(xì)胞膜上的各種離子通道參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、生長(zhǎng)等過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞系列生理生化代謝具有重要影響［3］。目前，關(guān)于離子通道與藥用成分次生代謝之間關(guān)系的研究報(bào)告很少。

本實(shí)驗(yàn)利用傳統(tǒng)酶解法［4］和快速酶解法［5］制備金鐵鎖原生質(zhì)體，并利用全細(xì)胞電流記錄手段比較了兩種方法獲得的原生質(zhì)體的質(zhì)量，為后續(xù)探討藥用植物與其他植物在細(xì)胞膜離子通道上是否存在差異提供合適的研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金鐵鎖愈傷組織繼代周期和培養(yǎng)條件按照參考文獻(xiàn)［1］進(jìn)行，培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L。

纖維素酶（Cellulase）R-10，購(gòu)于上海三杰生物技術(shù)有限公司；纖維素酶RS，購(gòu)于Yakult Honsha（Japan）；果膠酶（Pectolyase）Y-23，購(gòu)于Seishin Pharmaceutical（Japan）。

1.2 方 法

1.2.1 傳統(tǒng)酶解法

1.2.1.1 金鐵鎖愈傷組織原生質(zhì)體的分離

參考劉強(qiáng)［4］、王麗爽［6］等的方法并略作修改。取繼代13d 的愈傷組織1g，將其放入1 mL CPW-13M（101 mg/L KNO3，27 mg/L KH2PO4，246mg/L MgSO4·7H2O，1 480mg/L CaCl2·2H2O，13%甘露醇）溶液中暗孵育1h。加入10mL酶液（不同濃度組合的酶溶于CPW-8M 溶液中，pH 5.8），在24 ℃、60r/min的搖床上黑暗振蕩酶解。

1.2.1.2 原生質(zhì)的純化［7］

酶液經(jīng)200 目篩網(wǎng)過(guò)濾，800r/min 離心5min，棄上清液，重復(fù)3次，收集原生質(zhì)體。原生質(zhì)體懸浮于CPW-8M（101mg/L KNO3，27mg/L KH2PO4，246mg/L MgSO4·7H2O，1 480mg/L CaCl2·2H2O，8%甘露醇）洗滌液中，800r/min離心5min，棄上清液，重復(fù)3次。

1.2.2 快速酶解法

參照Pandey［5］的方法略作修改。取繼代13d的愈傷組織0.5g，加入1mL 酶液（0.1mmol/L KCl，0.1mmol/L CaCl2，10mmol/L Asc，0.5%BSA，1.2%纖維素酶RS，0.5% Pectolase Y-23，滲透壓用山梨醇調(diào)節(jié)至400 mmol/kg，pH 5.5）在22 ℃，45r/min的搖床上黑暗震蕩反應(yīng)15min，加入300μL 的基本介質(zhì)（10mmol/L 谷氨酸鉀，10 mmol/L Mes，1 mmol/L CaCl2，4mmol/L MgCl2，滲透壓用山梨醇調(diào)節(jié)至400mmol/kg，pH 5.8）再反應(yīng)5min后出現(xiàn)個(gè)別脫落的原生質(zhì)體，加入等體積基本介質(zhì)5min后，過(guò)雙層濾網(wǎng)，然后450r/min預(yù)離心4min，去掉最上部2 mL 和最下部1 mL，取中間部分700r/min離心10min，保留最下面1mL，重復(fù)2次，收集原生質(zhì)體。

1.2.3 金鐵鎖原生質(zhì)體內(nèi)向K+電流的測(cè)定

將0.5mL原生質(zhì)體懸浮液加入到4.5 mL基本介質(zhì)中，靜置10 min，在倒置顯微鏡下選取胞質(zhì)清晰、膜完整性良好的原生質(zhì)體，移動(dòng)含有電極液（80 mmol/L 谷氨酸鉀，20 mmol/L KCl，10mmol/L Hepes，5 mmol/L ATP-Mg，滲透壓用山梨醇調(diào)節(jié)至500 mmol/kg，pH 7.2）的玻璃微電極，添加適當(dāng)負(fù)壓，進(jìn)行封接。刺激電壓從-190mV逐漸去極化到+100 mV，每級(jí)為+20mV，維持時(shí)間3s，頻率為0.2 Hz，全細(xì)胞封接形成10 min 后采集數(shù)據(jù).使用Pulse+Pulsefit軟件采集和分析全細(xì)胞電流［7］。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳統(tǒng)酶解法制備金鐵鎖原生質(zhì)體

2.1.1 酶液濃度組合對(duì)分離原生質(zhì)體的影響

在不同濃度組合的酶液處理下，相同酶解時(shí)間，原生質(zhì)體產(chǎn)率明顯不同。由表1可見(jiàn)，原生質(zhì)體的產(chǎn)率隨著酶濃度的升高而有顯著提升，在2%纖維素酶R-10+1%果膠酶Y-23組合下產(chǎn)率最高。當(dāng)濃度繼續(xù)提高時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)率反而下降。每種植物細(xì)胞壁中纖維素和果膠的含量都不相同，需要選擇最適的酶液組合濃度使原生質(zhì)體的產(chǎn)率達(dá)到最高，但過(guò)高的酶液濃度反而會(huì)對(duì)制得的原生質(zhì)體產(chǎn)生損傷，使其質(zhì)膜迅速破裂、細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)分離原生質(zhì)體的影響

每隔1h，觀察一次原生質(zhì)體的酶解情況。酶解2h后就出現(xiàn)了少量的原生質(zhì)體，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體的數(shù)量不斷增加，在7h時(shí)產(chǎn)率達(dá)到最高。隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，原生質(zhì)體數(shù)量開(kāi)始減少，碎片不斷增多，說(shuō)明已經(jīng)產(chǎn)生的原生質(zhì)體破裂，整體瓦解了（見(jiàn)圖1）。

表1 酶液濃度組合對(duì)原生質(zhì)體分離的影響Tab.1 Effect s of enzyme concentration on separation of protoplasts

圖1 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的影響Fig.1 Effects of zymohydrolysis time on protoplast isolation

2.2 快速酶解法制備金鐵鎖原生質(zhì)體

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)分離原生質(zhì)體的影響

將酶液進(jìn)行一定程度的稀釋，可以精確控制酶解時(shí)間，即使酶解時(shí)間稍長(zhǎng)，也會(huì)由于其濃度較低，使得對(duì)細(xì)胞膜的損傷較小。但如果將酶液濃度稀釋很低，雖然可以更好地掌握酶解時(shí)間，但是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易產(chǎn)生特別微小的細(xì)胞碎片和滋生微生物，將玻璃微電極的前端堵塞。如果不將酶液稀釋，25min即產(chǎn)生大量的原生質(zhì)體和碎片，在離心過(guò)程中高效的酶液依然發(fā)揮作用，一段時(shí)間后產(chǎn)生的原生質(zhì)體大部分發(fā)生破裂。在酶液反應(yīng)15min后，加入300μL 的基本介質(zhì)將其稀釋，繼續(xù)反應(yīng)5min后，大的細(xì)胞團(tuán)開(kāi)始脫落，繼續(xù)加入1mL 基本介質(zhì)將酶液進(jìn)一步稀釋，反應(yīng)5min后，少數(shù)細(xì)胞變圓成為原生質(zhì)體，但大部分的細(xì)胞仍有殘余的細(xì)胞壁。在離心過(guò)程中殘余的酶液會(huì)繼續(xù)酶解部分細(xì)胞的細(xì)胞壁，雖然最終獲得的原生質(zhì)體數(shù)量較少，但由于酶解時(shí)間短，使細(xì)胞膜受到的損傷較小，完整性良好。

2.2.2 滲透壓對(duì)分離原生質(zhì)體的影響

將產(chǎn)生的原生質(zhì)體放于300、350、400、450、500mmol/kg的基本介質(zhì)中，4 ℃冰箱中過(guò)夜觀察，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，4℃冰箱中過(guò)夜后，400mmol/kg下原生體保存的數(shù)量最多，且胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞膜厚實(shí)圓滑。

表2 滲透壓對(duì)原生質(zhì)體分離的影響Tab.2 Effect of osmotic pressure on protoplasts isolation

2.3 不同酶解法下獲得的原生質(zhì)體對(duì)膜片鉗實(shí)驗(yàn)的影響

傳統(tǒng)酶解法雖然產(chǎn)生的原生質(zhì)體較多，但因?yàn)榧?xì)胞膜與酶液接觸時(shí)間較長(zhǎng)受到了不同程度的損害，使得制得的原生質(zhì)體無(wú)彈性、易破碎，不適宜用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；并且因?yàn)槊附鈺r(shí)間較長(zhǎng)，分離純化不夠徹底，原生質(zhì)體懸浮液中存在大量細(xì)小細(xì)胞碎片和滋生微生物，極易將玻璃微電極的前端堵塞。而快速酶解法獲得的原生質(zhì)體雖然數(shù)量較少，但與酶液直接接觸的時(shí)間短，細(xì)胞膜受到的損傷很小，制得的原生質(zhì)體完整、彈性好，靜置1h左右就可以用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)，原生質(zhì)體懸浮液中滋生微生物的可能性較小。綜合考慮，快速酶解法制得的原生質(zhì)體更適合作為膜片鉗實(shí)驗(yàn)的材料。

2.4 金鐵鎖細(xì)胞原生質(zhì)體的鉀電流特征

靜息電位是指細(xì)胞在未受刺激條件的非興奮狀態(tài)下的膜電位，在此情況下細(xì)胞膜主要處于鉀離子平衡電位水平，靜息電位主要由內(nèi)向整流性鉀離子通道參與形成的。在實(shí)驗(yàn)條件下，金鐵鎖細(xì)胞的靜息電位在-52mV 左右，內(nèi)向K+電流在100～350 pA，比擬南芥這一模式植物高100pA 左右，電流強(qiáng)度隨刺激電壓的變化而穩(wěn)定平滑（圖2），所以，快速酶解法制得的原生質(zhì)體更適合作為膜片鉗實(shí)驗(yàn)的材料測(cè)定細(xì)胞全電流。

3 結(jié)論

本文以金鐵鎖愈傷組織為材料，研究了兩種不同酶解法制得原生質(zhì)體的條件，并分析比較了兩種不同酶解方法下制得的原生質(zhì)體。

（1）利用傳統(tǒng)酶解法制備金鐵鎖原生質(zhì)體，產(chǎn)率隨著酶濃度的變化先升高后降低，在2% 纖維素酶R-10+1% 果膠酶Y-23 下產(chǎn)率最高；原生質(zhì)體的數(shù)量隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)也是先增加后減少，在7h時(shí)產(chǎn)率最高。

圖2 金鐵鎖原生質(zhì)體全細(xì)胞質(zhì)膜電流特征Fig.2 Characteristic of the whole-cell currents of P.tunicoides protoplasts

（2）快速酶解法制備原生質(zhì)體，酶解時(shí)間短，相對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間處理，細(xì)胞膜受到的損傷小，完整性更好；4 ℃冰箱過(guò)夜、400mmol/kg滲透壓下的原生體保存的數(shù)量最多，且胞質(zhì)飽滿，細(xì)胞膜厚實(shí)圓滑，同時(shí)認(rèn)為快速酶解法制得的原生質(zhì)體是進(jìn)行金鐵鎖細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)的良好材料，為后續(xù)的工作奠定了基礎(chǔ)。