楊易+董穎+陳晨+徐斌+但晴+李泱

【摘要】 目的 觀察大蒜素（Gar）對H9c2細(xì)胞鈉電流的影響。方法 取培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞， 采用全細(xì)胞膜片鉗記錄鈉電流。觀察Gar對鈉電流和門控機(jī)制的影響。結(jié)果 Gar對INa的抑制效應(yīng)呈電壓依賴性。-30 mV時(shí)， 200 μmol/L Gar可使INa由（-98.4±5.6）pA/pF降低為（-66.5±5.3）pA/pF （P<0.01）。藥物使INa半激活電壓V1/2向去極化方向移動， 減少通道開放， 從而減少INa電流峰值密度。200 μmol/L 的Gar可以使鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線向去極化方向移動， 半激活電壓（V1/2， act）從（-50.6±5.4）mV移至（-27.8±3.2）mV（P<0.01）， 激活曲線斜率（kact）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 大蒜素可能通過減少鈉通道激活， 降低鈉電流。

【關(guān)鍵詞】 大蒜素；H9c2細(xì)胞；鈉電流；膜片鉗

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.27.192

【Abstract】 Objective To observe influence by garlcini （Gar） on H9c2 cell sodium current. Methods Sodium current in cultured H9c2 cells of rat cardiac muscle cell line was recorded by whole-cell patch clamp. Observation was made on influence by Gar on sodium current and gating mechanism. Results Inhibiting effect on INa showed its voltage dependency by Gar. With -30 mV， 200 μmol/L Gar decreased INa from （-98.4±5.6） pA/pF to （-66.5±5.3） pA/pF （P<0.01）. Peak value density of INa was reduced by medication which led INa half activation voltage V1/2 toward depolarization and reduced opened channel. Depolarization move of steady-state activation curve in sodium channel was induced by 200 μmol/L Gar. Half-activation voltage （V1/2，act） moved from （-50.6±5.4） mV to （-27.8±3.2） mV （P<0.01）. The difference of activation curve slope （kact） had no statistical significance （P>0.05）. Conclusion Garlcini can reduce sodium current by decreasing sodium channel activation.

【Key words】 Garlcini； H9c2 cell； Sodium current； Patch clamp

心律失常是最常見的心血管疾病之一， 而心肌細(xì)胞鈉離子通道電流在心肌電活動中起著主要的作用。其不僅貢獻(xiàn)動作電位的0相除極， 也決定著心肌細(xì)胞的有效不應(yīng)期， 該通道突變可以導(dǎo)致Brugada綜合征、LQT3和家族性房顫等多種遺傳性心律失常[1， 2]， 鈉通道也是一類抗心律失常藥物的作用靶點(diǎn)。然而， 一類抗心律失常藥物多具有副作用， 從而制約了它們的應(yīng)用[3]。亟需尋找新的抗心律失常藥物。Gar是一種從百合科植物大蒜鱗莖中分離出的具有多種生物學(xué)活性的化合物。在心血管疾病領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到重視， 該成份可以改善缺血心肌的供養(yǎng)， 具有抗心律失常作用[4]。本文選擇大鼠心肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞， 用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察Gar對INa的影響， 以期為開發(fā)新的抗心律失常藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料 胰蛋白酶、牛血清白蛋白、天門冬氨酸鉀、丙酮酸鈉、MgATP、HEPES、CaCl2、CdCl2、TTX均為Sigma公司產(chǎn)品；EGTA購自Fluka Biochemika；DMEM-F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國 Gibico公司。

細(xì)胞外液（mmol/L）：NaCl 130， CaCl2 2， CsCl 5， MgCl2 1.2， HEPES 10和glucose 5， CsOH調(diào)pH至7.4。于細(xì)胞外液加入4-AP 5 mmol/L阻斷Ito。

細(xì)胞內(nèi)液（mmol/L）：CsCl 100、TEA-Cl 20、EGTA 10、Na2-ATP 5、HEPES 10， CsOH調(diào)pH調(diào)至7.2。

1. 2 H9c2細(xì)胞的培養(yǎng) H9c2 心肌細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。在37℃、5% CO2 條件下培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的 DMEM-F12培養(yǎng)基中。0.25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞， 制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種在直徑為1.4 cm的蓋玻片上， 37℃培養(yǎng)貼壁。

1. 3 藥物及應(yīng)用 Gar購于上海禾風(fēng)制藥有限公司， 純品是無色或淡黃色油狀物， 相對分子質(zhì)量為162。臨用時(shí)用細(xì)胞外液制成終濃度， 細(xì)胞外恒流灌流方式給藥。

1. 4 全細(xì)胞膜片鉗記錄 將Axon-700B膜片鉗放大器（USA）同計(jì)算機(jī)連接。刺激信號及電壓輸入信號的采集應(yīng)用Digidata 1550A數(shù)模轉(zhuǎn)換器（USA）， 均由軟件（pCLAMP10.4） 控制。GG-17玻璃毛坯經(jīng)pp-83微電極拉制儀（Narishige Co. Japan）拉制成電阻為2.0～5.5 MΩ的電極。調(diào)節(jié)三維操縱器進(jìn)行封接， 使封接電阻達(dá)>1 GΩ， 吸破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞記錄模式。為消除細(xì)胞間的誤差， I值以電流密度（pA/pF）表示。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 大蒜素對H9c2細(xì)胞INa及電流電壓曲線的作用 30 mV時(shí)， 鈉峰電流密度（-98.4±5.6）pA/pF， 200 μmol/L Gar使電流密度降低為（-66.5±5.3）pA/pF， 比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。電流-電壓曲線顯示， 通道約在-70 mV激活， 峰值電位在-30 mV， 曲線呈陡峭倒鐘形。200 μmol/L 的Gar使各電壓下電流均被抑制， 尤其是-40～0 mV內(nèi)電流降低更為明顯。不同濃度Gar作用于INa的原始記錄圖。見圖1A。200 μM Gar 對INa電流峰值密度的作用。見圖1B。

2. 2 大蒜素對H9c2細(xì)胞INa穩(wěn)態(tài)激活和穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響 200 μmol/L 的Gar可以使鈉通道的穩(wěn)態(tài)激活曲線向去極化方向移動， 半激活電壓（V1/2， act）從（-50.6±5.4）mV移至（-27.8±3.2）mV（P<0.01）， 激活曲線斜率（kact）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。應(yīng)用Gar前后， 鈉通道穩(wěn)態(tài)失活曲線變化不大， 提示藥物對通道的失活過程影響較小。對INa電壓-電流曲線的作用。見圖2A。Gar 對INa穩(wěn)態(tài)激活曲線的作用。見圖2B。

2. 3 大蒜素對INa失活后恢復(fù)動力學(xué)的影響 200.0 μmol/L Gar使通道恢復(fù)時(shí)間常數(shù)延長， 失活后恢復(fù)曲線右移。

3 討論

本文發(fā)現(xiàn)， 大蒜素可以抑制心肌細(xì)胞系H9c2的INa， 使其電流密度降低。且隨著藥物濃度的增高， 其抑制效應(yīng)增大， 半數(shù)抑制濃度約為85.5 μmol/L。因此， 具有一類抗心律失常藥物的特征。另有報(bào)道， 其可以抑制大鼠心肌細(xì)胞ICa， L、IKr和Ito[5-10]， 可見其對離子通道電流的效應(yīng)是多重的， 這較符合現(xiàn)代抗理想心律失常藥物的特征。Gar抑制INa的效應(yīng)在電流峰電位附近更加明顯。

對通道門控機(jī)制和動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)， Gar主要從二個(gè)環(huán)節(jié)降低INa通道的開放， 即Gar可以使鈉通道激活曲線右移， 從而延遲通道激活；Gar還可使鈉通道失活后恢復(fù)時(shí)間延長， 從而減緩?fù)ǖ朗Щ詈蟮脑俅渭せ?。這可能是其降低INa的機(jī)制之一。但本研究從細(xì)胞電生理角度解釋了Gar抗心律失常的部分機(jī)制， 且該藥物具有多通道抑制特點(diǎn)， 符合現(xiàn)代抗心律失常藥物的理念[8]。

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[收稿日期：2016-07-07]