錢靜亞，張志才**，黃達明，崔鳳杰，鄭惠華，陳 惠

(1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇 南通226009)

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病，如何提高中藥的作用效果已成為糖尿病治療的重要問題。微生物尤其是藥用真菌轉化中藥為提高中藥治療糖尿病的效果提供了新的方向。1992年，南京中醫(yī)藥大學莊毅提出 “藥性菌質”的概念，建議用中草藥和營養(yǎng)基質為原料，用藥用真菌固體發(fā)酵，發(fā)酵完成后得到的基質、菌絲體、代謝產(chǎn)物的混合物稱為菌質，作為中藥[3]。1994年、1995年和2001年又提出 “藥用菌新型固體發(fā)酵工程技術”這一概念[4]。2001年，江南大學章克昌教授提出了 “藥用真菌生物轉化中藥”的概念，即藥用真菌轉化一種或多種中藥，同時提高藥用真菌和中藥的功效或產(chǎn)生新的療效降低中藥毒性[5]。同年，王興紅等提出利用微生物強大的分解轉化物質的能力，通過微生物的生長代謝和生命活動來炮制中藥，以更大幅度地增加中藥的的利用度，提高療效，降低毒副作用，擴大適應癥[6]；吳炳新等提出以優(yōu)選的有益菌群中的一種或幾種、一株或幾株益生菌作為菌種，加入中藥提取液中，再按照現(xiàn)代發(fā)酵工藝生產(chǎn)出含有中藥活性成分、菌體及其代謝產(chǎn)物的全組分發(fā)酵液的新型中藥發(fā)酵加工制劑[7]。

雞腿菇 （Coprinus comatus）鮮菇中含有多種生物活性物質，具有多種生理、藥用及保健作用[9－10]，民間用其治療糖尿病。丁重陽等還從雞腿菇發(fā)酵液中分離出一種多酚類化合物4,5－二羥基－2－甲氧基苯甲醛，這種活性成分具有顯著降血糖作用[11]。而桑葉富含具有降血糖、降血脂等的多糖、黃酮、生物堿等活性成分[12－14]，這些桑葉中的活性成分添加到發(fā)酵液中進行轉化有可能提高雞腿菇發(fā)酵液的活性成分含量，增強雞腿菇發(fā)酵液的功效。而王鋒等[15]在雞腿蘑發(fā)酵液中添加不同中藥進行液體培養(yǎng)，以四氧嘧啶誘發(fā)的糖尿病小鼠模型進行降血糖試驗，結果表明添加苦瓜的雞腿蘑發(fā)酵液有顯著降血糖作用。因此，本文研究雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液的降血糖作用，證明雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液可比單一雞腿菇發(fā)酵液或桑葉更好地降低糖尿病小鼠的血糖值，并通過測定模型小鼠的生理生化指標以及體重變化等情況，初步分析雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液在模型小鼠體內(nèi)的降血糖作用機理。本研究不僅為藥用真菌生物轉化中藥提供了參考，對于開發(fā)新的中藥治療糖尿病也具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

雞腿菇JS－09購于中國農(nóng)業(yè)科學研究院菌種保藏中心

1.1.2 動物

雄性昆明小鼠，6周齡，，購自南京江寧實驗動物中心，合格證號：SCXK蘇20020018

1.1.3 培養(yǎng)基

麩皮固體培養(yǎng)基：麩皮:水=1:1

馬鈴薯葡萄糖 （PG）培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，水1 000 mL

1.2 方法

1.2.1 雞腿菇發(fā)酵液、雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液及其濃縮物的制備

雞腿菇接種于滅菌后的麩皮固體培養(yǎng)基中，27℃恒溫培養(yǎng)7 d；將麩皮培養(yǎng)基中的菌種轉接于滅菌后的馬鈴薯葡萄糖 （PG） 培養(yǎng)基中， 25℃，160r·min－1振蕩 （往復式搖床，鎮(zhèn)江格瑞生物工程公司）培養(yǎng)3 d；將已培養(yǎng)好的一級菌種以體積分數(shù)10%的量接種到PG液體培養(yǎng)基中，25℃，160r·min－1振蕩培養(yǎng)7 d，即得雞腿菇發(fā)酵液；將一級菌種以體積分數(shù)10%的量接種到PG+0.6%桑葉液體培養(yǎng)基中，25℃，160r·min－1振蕩培養(yǎng)7 d，即得雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液，真空減壓濃縮，冷凍干燥，即為發(fā)酵液濃縮物，收率為 16.53g·L－1。

1.2.2 桑葉提取液的制備

0.5 g桑葉用100mL水高壓鍋120℃，30 min提取。

1.2.3 糖尿病模型小鼠的建立及小鼠分組

小鼠 （在通風、干燥、每天12 h光照、室溫18℃～22℃和濕度30%～50%動物房中，適應性喂養(yǎng)5 d，選擇10只作為正常對照組。其余禁食24 h，腹腔注射180 mg·kg－1體重新配制的四氧嘧啶造糖尿小病鼠模型。飼養(yǎng)5d后禁食5 h，尾部靜脈采血測定血糖，選取血糖值＞13mmol·L－1的小鼠作為實驗性糖尿病模型鼠。將四氧嘧啶誘導的高血糖模型小鼠分成5組，每組10只，分為模型對照組、純雞腿菇發(fā)酵液組、桑葉提取液組、雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液組每天按10 mL·kg－1體重劑量灌胃1次，連續(xù)灌胃 7 d后，禁食4 h，眼框靜脈采血測定血清中血糖含量。糖尿病模型小鼠建立方法參照前面，將四氧嘧啶誘導的高血糖模型小鼠分成7組，每組10只，分為模型對照組、二甲雙胍組 （陽性藥物對照組）、雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液組（五組，濃縮物灌胃劑量分別為：5 mg·kg－1、 10 mg·kg－1、20 mg·kg－1、 40 mg·kg－1和 80 mg·kg－1體重）。

1.2.4 小鼠生理生化指標的測定

正常組、模型對照組、二甲雙胍組和雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液組繼續(xù)灌胃14 d后，用乙醚麻醉，眼眶采血，血液樣品經(jīng)10 000×g，4℃離心 （BR4冷凍離心機 BR4i， 法國JOUAN公司）10min得血清 （John&Anne－Marie 2002），分析血清中的血糖值、果糖胺 （果糖胺試劑盒，南京建成生物工程研究所）、總膽固醇 （TC）和甘油三酯 （TG），其中TC和TG的分析由相應試劑盒 （北京中山生物技術有限公司）進行分析。

將采完血的小鼠迅速解剖，分離肝臟、腎臟，低溫離心制備組織勻漿上清液，分別測定肝臟、腎臟組織勻漿上清液中超氧化物歧化酶 （SOD）活性。SOD測定采用試劑盒 （南京建成生物工程研究所）法，操作步驟按試劑盒說明進行。

1.2.5 雞腿菇發(fā)酵液、雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液中成分的測定

黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉－三氯化鋁法，以蘆丁制作標準曲線；多酚含量的測定采用福林酚法，以沒食子酸制作標準曲線；多糖的測定采用苯酚硫酸法。

1.2.6 統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS14.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，試驗數(shù)據(jù)以均值±方差 （mean±SD）的形式表示。各組間試驗數(shù)據(jù)比較采用單因素單尾方差分析。P＜0.05表示組間差異達到顯著水平；P＜0.01表示組間差異達到極顯著水平。

2 結果

2.1 純雞腿菇發(fā)酵液、桑葉提取液和雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液對糖尿病小鼠血糖的影響

純雞腿菇發(fā)酵液、桑葉提取液和雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液對糖尿病小鼠血糖的調(diào)節(jié)作用見表1。與正常對照組相比，其它試驗組的血糖都顯著提高。各模型組之間血糖值無顯著差異 （P＞0.05），說明模型鼠是穩(wěn)定可用的。和模型對照組相比，純雞腿菇發(fā)酵液組、桑葉提取液組和雞腿菇轉化桑葉組血糖值顯著低于模型對照組 （P＜0.01），說明這三種供試樣品以10 mL·kg－1體重劑量灌胃能產(chǎn)生顯著降血糖作用。試驗后雞腿菇轉化桑葉組的血糖顯著低于桑葉提取液組和純雞腿菇發(fā)酵液組，說明雞腿菇轉化桑葉提取液提高了單一雞腿菇發(fā)酵液或桑葉提取液的降血糖作用，因此選擇雞腿菇轉化桑葉組作進一步研究。

表1 純雞腿菇發(fā)酵液、桑葉提取液和雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液對糖尿病小鼠血糖的影響

2.2 雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液試驗劑量的確定

糖尿病小鼠喂食不同劑量雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液濃縮物后結果見表2，雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液對糖尿病小鼠血糖的調(diào)節(jié)作用呈劑量依賴性關系，在低劑量范圍內(nèi)作用不顯著，而當劑量大于10 mg·kg－1體重時，血糖顯著降低。在劑量大于20 mg·kg－1體重時，不僅血糖有顯著降低，而且血清中果糖胺指標有極顯著差異，由于果糖胺可以反應近15 d的血糖值，因此綜合這兩項指標，選擇雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液濃縮物劑量為 20 mg·kg－1體重作進一步研究。

2.3 雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液對血脂代謝的影響

不同處理組小鼠的血脂值如表3所示。模型對照組小鼠甘油三酯極顯著高于正常對照組 （P＜0.01），而雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液組甘油三酯與模型對照組有極顯著差異（P＜0.01），同時與二甲雙胍組相比也有顯著差異 （p＜0.05），說明雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液能極顯著的降低糖尿病小鼠血清中甘油三酯含量，作用效果顯著優(yōu)于二甲雙胍；另外，雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液組膽固醇值與模型對照組相比無統(tǒng)計學差異 （P＞0.05），表明雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液對糖尿病小鼠血清中總膽固醇含量無明顯影響。

表2 不同劑量的雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液對四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠的作用

表3 不同處理組血清中血脂的比較

2.4 雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液對超氧化物歧化酶 （SOD）活性的影響

SOD是一種廣泛存在于生物體內(nèi)與細胞氧化代謝密切相關的蛋白質，是活性氧自由基的天然消除劑，也是抗氧化酶系中最先與活性氧自由基結合的酶類。SOD能特異性結合體內(nèi)超氧陰離子，且可與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH－Px)協(xié)同作用防止脂質過氧化及其代謝產(chǎn)物對機體的損害[16]，還可直接捕捉和清除超氧陰離子等自由基[17]。

表4 不同處理組肝臟和腎臟中超氧化物歧化酶活性的比較

由表4可知模型對照組糖尿病小鼠肝臟和腎臟中SOD酶活性顯著低于正常對照組 （P＜0.05），而雞腿菇發(fā)酵液組中SOD酶活性顯著高于模型對照組 （P＜0.01），這說明雞腿菇發(fā)酵液可以顯著提高糖尿病小鼠的體內(nèi)抗氧化能力，從而可降低糖尿病小鼠體內(nèi)因長期的氧化應激對組織器官造成的氧化損傷。

2.5 雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液對丙二醛的影響

丙二醛 (MDA)為體內(nèi)脂質氧化終產(chǎn)物，它能使蛋白質、核酸、脂類發(fā)生交聯(lián)，使生物膜變性、細胞突變、衰老或死亡。MDA也是反映氧化損傷的指標之一，其生成量隨氧自由基生成的增加而增加[18]。

表5 不同處理組血清中丙二醛含量的比較

不同處理組小鼠血清中丙二醛含量見表5。模型對照組糖尿病小鼠的血清中丙二醛含量明顯高于正常對照組小鼠 （P＜0.05），從另一方面說明糖尿病小鼠造模成功，雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液組糖尿病小鼠血清中丙二醛含量極顯著低于模型對照組 （P＜0.01），這表明雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液具有明顯的降低體內(nèi)脂質過氧化的功效，從而減輕細胞損傷的程度。

2.6 對小鼠體重的影響

表6 各組實驗小鼠體重變化

由表6知，試驗前各組間體重無顯著差異 （P＞0.05），說明各組體重具有可比性。試驗后，模型對照組糖尿病小鼠體重明顯比正常小鼠體重低，而雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液組糖尿病小鼠體重顯著高于模型對照組 （P＜0.01），說明雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液可以減少糖尿病小鼠體重下降。

2.7 轉化前后雞腿菇發(fā)酵液成分分析

黃酮類化合物可通過抗氧化、維護生物膜穩(wěn)定，保護胰組織、調(diào)節(jié)與糖代謝有關酶類的釋放及其活性、干擾小腸對糖的吸收、使餐后血糖峰值后移與降低、胰島素樣作用、促進外周組織利用糖、調(diào)整糖代謝、抗胰腺炎炎癥損傷、抑制醛糖還原酶和抑制蛋白糖基化等抗糖尿病及其并發(fā)癥[19]。而多酚類化合物具有清除自由基，提高機體抗氧化能力的顯著作用，具有一定輔助預防和治療糖尿病功效。

表7 轉化前后雞腿菇發(fā)酵液成分分析

從表7中可以看出，桑葉的成分改變了雞腿菇中成分的組成，雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液中小分子活性物質黃酮和多酚類化合物含量增加，而大分子物質多糖含量則降低。

通過C－18柱層析和HP－20柱進一步分離雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液，得到一種具有抑制蛋白質非酶糖基化活性的物質，綜合質譜、紅外光譜和核磁圖譜數(shù)據(jù)分析該化合物結構為4,5－二羥基－2－甲氧基苯甲醛，結構圖見圖1。丁重陽等研究發(fā)現(xiàn)該成分具有顯著的調(diào)節(jié)血糖作用[11]，含量分析顯示，沒有添加桑葉的雞腿菇發(fā)酵液該成分含量為1.62 mg·mL－1，添加桑葉后的雞腿菇發(fā)酵液該活性成分含量為 2.52 mg·mL－1。

圖1 4,5-二羥基-2-甲氧基苯甲醛結構圖

3 討論

我國利用中醫(yī)藥在糖尿病的預防和治療上已經(jīng)積累了豐富的經(jīng)驗，隨著藥用真菌生物轉化中藥技術的出現(xiàn)與發(fā)展，傳統(tǒng)中醫(yī)藥與現(xiàn)代生物工程發(fā)酵技術結合而形成的高科技中藥制藥新技術將大大推進中藥防治糖尿病的應用進程。

雞腿菇轉化桑葉的發(fā)酵液比單一雞腿菇發(fā)酵液或桑葉更好地降低了糖尿病小鼠血清中的血糖值，通過測定甘油三酯、總膽固醇、丙二醛以及超氧化物歧化酶指標，發(fā)現(xiàn)雞腿菇轉化桑葉的發(fā)酵液不僅降低了甘油三酯、丙二醛含量，同時提高了臟器中超氧化物岐化酶活性。轉化后的發(fā)酵液中黃酮類化合物含量以及多酚類化合物含量均有所增加，說明轉化后發(fā)酵液的抗氧化及抗自由基的功效都有所增強，另外，具有血糖調(diào)節(jié)作用的4,5－二羥基－2－甲氧基苯甲醛含量也有所提高，這些為雞腿菇轉化桑葉發(fā)酵液的降血糖作用提供了堅實的理論支持。糖尿病患者體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多，機體抗氧化防御作用減弱，體內(nèi)自由基不能被完全清除而積累。自由基性質活潑，又極易與其他物質發(fā)生反應而形成新的自由基或活性氧類氧化物，而且反應往往呈連鎖性。自由基的這種強氧化作用使其所參與的反應直接或間接地對機體造成危害，其主要損傷反應包括蛋白質氧化、DNA突變甚至斷裂、脂質氧化、細胞膜起泡等一系列糖尿病并發(fā)癥。而雞腿菇轉化桑葉的發(fā)酵液可能就是通過提高肌體抗氧化能力和清除自由基而達到降血糖的目的。

張志才等用猴頭菌對銀杏葉粗提物EGB進行轉化，結果發(fā)現(xiàn)猴頭菌轉化EGB的發(fā)酵液對2型糖尿病的血糖調(diào)節(jié)作用比未轉化的發(fā)酵液顯著提高[20]，而雞腿菇轉化桑葉的發(fā)酵液也證明其降血糖作用進一步增強，這些研究為藥用真菌生物轉化中藥提高作用效果提供了借鑒，推動了藥用真菌生物轉化中藥治療疾病的深入研究。

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