劉偉，孫婷，張研，孫效文

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心，北京100141;2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023;3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306)

水產(chǎn)品具有低脂肪、高蛋白的特點，是合理膳食結(jié)構(gòu)中不可缺少的重要部分，是人們攝取動物蛋白的主要方式之一［1］。魚類的肉質(zhì)主要取決于肌肉中水分、脂肪、氨基酸含量特別是鮮味氨基酸的含量等因素［2］。脂肪對魚類本身的營養(yǎng)以及魚類脂肪酸對人類的健康都具有重要作用［3-4］。通過基因組關(guān)聯(lián)研究 (GWAS)發(fā)現(xiàn)，KCTD15(Potassium channel tetramerization domain containing 15)在多個人群中被確定為與脂肪過多相關(guān)聯(lián)的基因之一［5-7］。Dutta 等［8］研究表明，KCTD15 基因異常表達(dá)抑制神經(jīng)嵴的分化，而敲除KCTD15基因則導(dǎo)致神經(jīng)嵴的擴張，即KCTD15基因可抑制神經(jīng)嵴的擴張使其保持正常范圍，而神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與生長發(fā)育密切相關(guān)。目前，關(guān)于KCTD15基因的研究報道較少，其功能也尚未確定［7］。鯉Cyprinus carpio是中國最重要的淡水養(yǎng)殖品種之一，KCTD15基因在鯉中的表達(dá)規(guī)律和功能目前尚未見報道。本研究中，作者克隆了鯉KCTD15基因，并利用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR方法檢測其在鯉不同組織和胚胎發(fā)育時期的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究KCTD15基因的功能，從而改善鯉的脂肪含量和促進(jìn)其生長 (胚胎)發(fā)育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用鯉采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，暫養(yǎng)于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心。取新鮮鯉組織(血液、腦、肝胰臟、脾、頭腎、體腎、腸、鰓、心臟、皮膚、肌肉、卵巢和精巢)分別保存在RNAsafeguard里;取受精后0、6、12、24、36、48、72 h的受精卵及破膜后3 d和10 d的全魚，均保存在冰箱(-80℃)中備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 用TRIZOL法 (Invitrogen，USA)分別提取血液、腦、肝胰臟、脾、頭腎、體腎、腸、鰓、心臟、皮膚、肌肉、卵巢和精巢以及受精后0、6、12、24、36、48、72 h、破膜后3 d和10 d的全魚總RNA，并用無核甘酸水處理。反轉(zhuǎn)錄為 cDNA之前，用NanoVue Plus Spectrophotometer(GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ，USA)檢測RNA的含量，并用15 g/L瓊脂糖膠檢測其完整性。每種組織取3 μg RNA，先用DNaseI(Amplification grade，Invitrogen)進(jìn)行前處理以去掉其中的DNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (引物為Oligo(dT))合成cDNA第一條鏈，最后用RNase去掉剩余RNA。cDNA樣品均用無核甘酸水稀釋10倍備用。

1.2.2 KCTD15基因在鯉中的克隆、測序與進(jìn)化樹的構(gòu)建 利用斑馬魚KCTD15a與KCTD15b基因序列與鯉EST以及基因組序列進(jìn)行Blastn比對，得到鯉KCTD15a與KCTD15b基因序列。采用3 μg全魚 RNA(包含所有組織)反轉(zhuǎn)錄得到全魚cDNA，用引物設(shè)計軟件Primer 5.0設(shè)計擴增KCTD15a與KCTD15b基因的引物為KCTD15a-3F、3R、4F、4R 及 KCTD15b-5F、5R、6F、6R(表1)，設(shè)計的引物要跨越至少一個內(nèi)含子，以防基因組污染而產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。所有的引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，使用前將引物稀釋至10 mm/L。擴增得到的片段用PMD-18T載體克隆并測序。通過Blastn比對分析，調(diào)取與KCTD15基因開放閱讀框序列相似度較高的其他物種KCTD15基因開放閱讀框序列，使用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，計算方法為鄰位相連法 (Neighbor-joining)，采用自展內(nèi)部分枝法 (Bootstrapping)評定進(jìn)化樹的可靠性，重復(fù)次數(shù)為1 000，并利用BioEdit 7.0.1軟件推測氨基酸序列。

1.2.3 KCTD15基因在鯉組織中的表達(dá) 采用半定量RT-PCR法檢測KCTD15基因在鯉組織中的表達(dá)，用Primer 5.0設(shè)計引物為KCTD15a-3F、3R和KCTD15b-5F、5R以及 β-actin-F、β-actin-R(表1)。確定適當(dāng)?shù)难h(huán)數(shù)，使擴增產(chǎn)物處在平臺期前的線性增長范圍內(nèi)，并用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。基因β-actin與KCTD15的PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括鯉 cDNA 模板 1.0 μL，10×buffer 2.0 μL，0.2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，Taq 酶 (1.0 U)0.1 μL，2.0 mmol/L MgCl21.2 μL，引物 1 μL，最后用ddH2O補至20 μL。反應(yīng)程序為:95℃下預(yù)變性5 min;95℃下變性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進(jìn)行13～36個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min，4℃下保存。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，用溴化乙錠染色后在紫外燈下觀察確定循環(huán)數(shù)。根據(jù)每個目的基因所確定的循環(huán)數(shù)對目的基因進(jìn)行13個鯉組織cDNA的PCR擴增，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.4 KCTD15基因在鯉胚胎發(fā)育時期的表達(dá)選取鯉受精后0、12、24、36、48、72 h和破膜后3 d、10 d的cDNA，采用實時定量 (熒光定量)法檢測鯉胚胎發(fā)育時期的表達(dá)。用Primer 5.0設(shè)計引物為KCTD15a-5F、5R和KCTD15b-7F、7R以及β-actin-F、β-actin-R(表1)。目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線是以全魚cDNA 10倍系列稀釋為模板(1.0× 10-1，1.0 × 10-2，1.0 × 10-3，1.0 ×10-4，1.0×10-5copies/mL)，PCR 反應(yīng)體系共 15 μL，包括鯉 cDNA(100 ng/μL)1.0 μL，上、下游引物混合液 (10 μmol/L)0.3 μL，SYBR Green reagent(東洋紡)7.5 μL，最后用 ddH2O補至15 μL。反應(yīng)程序為:95℃下預(yù)變性15 min;95℃下變性15 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。平行試驗設(shè)3個重復(fù)，所有樣品檢測均設(shè)置陰性對照 (無模板)。反應(yīng)在7500 PCR儀 (Applied Biosystems)上進(jìn)行。每個目的基因的相對表達(dá)以內(nèi)參β-actin為校準(zhǔn)，采用2-△△CT法［9］來計算，所得數(shù)據(jù)由7500 PCR儀自帶的軟件分析。采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

表1 試驗設(shè)計的引物序列Tab.1 The primers used in the experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 鯉KCTD15基因全長cDNA序列及分析

利用斑馬魚KCTD15基因序列以鯉全魚cDNA為模板進(jìn)行同源克隆，確定了2個鯉KCTD15基因，分別與斑馬魚KCTD15a、KCTD15b基因相對應(yīng)。從圖1可見，鯉KCTD15a和KCTD15b基因全長cDNA均為774 bp，包含4個外顯子，編碼257個氨基酸殘基的多肽。通過 Blastn比對，鯉KCTD15a和 KCTD15b基因與斑馬魚 KCTD15a、KCTD15b基因的相似性分別為90%和93%，用ExPASY在線軟件預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)相對分子量均為29 000，PI分別為7.0和6.5。

圖1 鯉KCTD15基因ORF序列及其編碼氨基酸Fig.1 The ORF nucleotide and deduced amino acid sequences of the gene KCTD15 in common carp

用Smart在線軟件分析鯉KCTD15a、KCTD15b基因的氨基酸序列 (圖1)，結(jié)果表明二者在30～132個氨基酸均含有相同的BTB模塊 (BTB模塊被發(fā)現(xiàn)位于某些C2H2型的鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子N末端，是一種進(jìn)化保守的蛋白質(zhì)——蛋白質(zhì)相互作用模塊［10］)。

從圖2可見:鯉KCTD15a和KCTD15b與斑馬魚［8］、人［5-7］、小鼠［11］具有高度同源性，且在魚類中同源性較高，但魚類比哺乳動物少26個氨基酸，推測可能與物種進(jìn)化有關(guān)，且第150和155位點分別為D和E，與其他種類也不同，這可能是導(dǎo)致同物種不同基因間或不同物種相同基因間功能不同的原因之一。劉春偉等［12］指出，可能由于進(jìn)化程度的不同，導(dǎo)致OLR1基因在不同物種間同源性差異較大。

圖2 KCTD15基因氨基酸序列Blastp比對結(jié)果Fig.2 Blastp results of the amino acid sequences of the gene KCTD15

進(jìn)化樹 (圖3)分析表明，哺乳動物、魚類和爪蟾的KCTD15基因分別聚類，這與物種的分類地位相符。鯉KCTD15a基因與斑馬魚KCTD15a基因聚類，鯉KCTD15b基因與斑馬魚KCTD15b基因聚類，推測KCTD15a與KCTD15b基因的分化早于斑馬魚和鯉的分化，但需要進(jìn)一步的研究方能確定。Clark等［13］指出，果蠅的基因和基因組的進(jìn)化可能與它們的生物學(xué)特點和適應(yīng)性相關(guān)聯(lián)。

2.2 KCTD15基因在鯉組織中的表達(dá)

采用RT-PCR方法檢測KCTD15基因在鯉組織中的表達(dá)。將β-actin與KCTD15基因在同一管中擴增進(jìn)行競爭性試驗，只有β-actin基因有表達(dá)，目的基因沒有表達(dá)，且兩者到達(dá)擴增平臺期的循環(huán)數(shù)不同，因此，需進(jìn)行單獨擴增。分別用6個不同循環(huán)數(shù) (21、24、27、30、33、36個循環(huán))對目的基因進(jìn)行擴增，分析擴增產(chǎn)物的15 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，以條帶亮度觀察是否進(jìn)入平臺期作為選擇循環(huán)數(shù)的依據(jù)。從圖4可見:KCTD15a基因在36個循環(huán)時達(dá)到最亮，在33個循環(huán)時亮度基本保持不變，說明在33個循環(huán)時已進(jìn)入平臺期，最后選取32個循環(huán)為PCR擴增循環(huán)數(shù)。同理，KCTD15b基因在32個循環(huán)時進(jìn)入平臺期，β-actin基因在23個循環(huán)時進(jìn)入平臺期。

圖3 KCTD15基因進(jìn)化樹Fig.3 The evolutionary tree of the gene KCTD15

圖4 確定循環(huán)數(shù)的凝膠電泳圖Fig.4 The amplification numbers confirmed

RT-PCR結(jié)果表明:KCTD15a基因只在頭腎中表達(dá)且較低，在其他組織中均不表達(dá);KCTD15b基因在卵巢中表達(dá)最高，在鰓和皮膚中次之，在腦、肝胰臟、頭腎、腸等組織中表達(dá)最低(圖5、圖6)。

鯉KCTD15a和KCTD15b雖結(jié)構(gòu)相似，但功能可能存在較大差異。KCTD15是與人身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和脂肪量有關(guān)的基因之一［5-7］，鯉卵巢含有豐富的脂肪酸［14-15］，KCTD15b在卵巢中表達(dá)最高，KCTD15b可能與鯉卵巢脂肪酸含量較多有關(guān)，推測與鯉的產(chǎn)卵、繁殖有關(guān)。KCTD15a和KCTD15b的組織表達(dá)差異性，間接地證實了之前推測的KCTD15b與哺乳動物同源基因的親緣性比KCTD15a近是正確的。

圖5 鯉KCTD15基因組織表達(dá)凝膠電泳圖Fig.5 The expression of the gene KCTD15 in tissues of common carp

圖6 鯉KCTD15基因在各組織中的表達(dá)量Fig.6 The relative expression of the gene KCTD15 in tissues of common carp

2.3 實時熒光定量PCR

采用實時熒光定量相對定量中的2-△△CT法檢測鯉 KCTD15基因的時間表達(dá)。從圖7可見:KCTD15a基因在受精后0 h表達(dá)量最高 (P＜0.05)，在受精后6 h和12 h均迅速下降 (P＜0.05)，在受精后36 h有所上升，但未達(dá)到6 h的水平，在受精后72 h及破膜后3 d、10 d時表達(dá)量逐漸降低;KCTD15b基因同樣在受精后0 h表達(dá)量最高 (P＜0.05)，在受精后6 h和12 h均迅速呈梯度下降 (P＜0.05)，在受精后36 h降至最低，在受精后72 h及破膜后3 d時逐漸升高，但幅度不大，在受精后10 d時再次下降。KCTD15b基因的表達(dá)量總體上高于KCTD15a基因的表達(dá)量。推測鯉胚胎前期 (12 h前)，KCTD15a和KCTD15b基因的功能具有一定的相關(guān)性。

Dutta等［8］指出，在斑馬魚和爪蟾發(fā)育初期KCTD15基因異常表達(dá)抑制神經(jīng)嵴的分化，而敲除KCTD15基因則導(dǎo)致神經(jīng)嵴的擴張。本研究中KCTD15基因在鯉發(fā)育初期表達(dá)量較高，后期表達(dá)較低，可能與神經(jīng)嵴的分化發(fā)育有關(guān)，而且KCTD15a與KCTD15b基因在腦中的表達(dá)量都較低，推測隨著鯉的生長，KCTD15在神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)減少或被抑制，說明KCTD15在魚類的胚胎及生長發(fā)育中具有重要的作用。

圖7 鯉KCTD15基因在胚胎發(fā)育時期的表達(dá)量Fig.7 The relative expression levels of the gene KCTD15 in common carp during embryonic and larval periods

3 結(jié)語

本研究中利用斑馬魚KCTD15基因與鯉基因組進(jìn)行Blastn比對，經(jīng)過克隆測序得到與斑馬魚相對應(yīng)的鯉KCTD15a和KCTD15b兩個基因。系統(tǒng)進(jìn)化樹和氨基酸序列比對分析顯示，鯉KCTD15基因與斑馬魚、人、食蟹猴、牛、小鼠、家鼠、爪蟾等的KCTD15基因存在高度同源性，KCTD15b基因與哺乳動物同源基因的親緣性比KCTD15a基因近。采用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR檢測了KCTD15a和KCTD15b基因的組織表達(dá)和胚胎發(fā)育時期的表達(dá)，結(jié)果顯示鯉KCTD15a和KCTD15b基因在組織中的表達(dá)存在較大差異，推測KCTD15b基因可能與鯉卵巢的脂肪含量有關(guān);KCTD15a和KCTD15b基因在發(fā)育初期表達(dá)趨勢相似，即受精后達(dá)到最大表達(dá)量，6 h后迅速下降，發(fā)育后期表達(dá)量均較少，推測KCTD15基因在胚胎發(fā)育初期有重要作用。KCTD15基因?qū)︳~類脂肪含量有何影響及其具體的生物學(xué)功能還沒有被確定，需進(jìn)一步通過熒光原位雜交、基因突變與敲除等技術(shù)研究該基因在魚類生長發(fā)育過程中的規(guī)律與作用。

致謝:對趙紫霞博士、李炯棠博士、冀培豐、萬玉美等人在采集試驗樣本、試驗操作和數(shù)據(jù)分析過程中提供的幫助表示衷心地感謝!

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