任立芹 趙 峰* 譚會(huì)澤 張建智 米寶民 趙江濤 張宏福

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.廣東溫氏集團(tuán)食品有限公司，新興 527439)

目前，國際上普遍采用氨基酸真消化率或標(biāo)準(zhǔn)氨基酸消化率來表達(dá)氨基酸的生物學(xué)效價(jià)[1-3]。而氨基酸真消化率都是通過測(cè)定氨基酸的表觀消化率與內(nèi)源性氨基酸的排泄量后計(jì)算得出。因此，選擇準(zhǔn)確測(cè)定內(nèi)源性氨基酸排泄量的方法對(duì)氨基酸真消化率的測(cè)定非常關(guān)鍵。在雞飼料氨基酸生物學(xué)效價(jià)的測(cè)定中，Sibbald[4]將用于雞飼料代謝能值測(cè)定的“排空強(qiáng)飼法”應(yīng)用于氨基酸真消化率的測(cè)定[1]，其內(nèi)源性氨基酸排泄量的測(cè)定是采用試驗(yàn)雞在排空48 h基礎(chǔ)上，通過收集與表觀氨基酸消化率測(cè)定相同時(shí)間內(nèi)的絕食雞的氨基酸排泄量估測(cè)。由于內(nèi)源性氨基酸的排泄量主要來源于消化液及脫落的腸壁細(xì)胞，絕食狀態(tài)下內(nèi)源性糞尿中氨基酸排泄量可能與采食待測(cè)飼料條件下內(nèi)源性損失不同，因此，許多學(xué)者建議使用無氮飼糧(N-free diet，NFD)測(cè)定內(nèi)源性氨基酸排泄量[5-6]。在絕食法與無氮飼糧法測(cè)定內(nèi)源性氨基酸排泄量的差異上，Song 等[2]、黎觀紅等[7]、翟少偉等[8]和 Muztar等[9]研究發(fā)現(xiàn)，無氮飼糧條件下雞內(nèi)源性氨基酸排泄量顯著高于禁食雞。Sibbald[1]和 Likuski等[10]卻發(fā)現(xiàn)，禁食條件下雞內(nèi)源性氨基酸排泄量與無氮飼糧條件下無顯著差異。由此可見，不同研究者在這2種方法的比較上得出了不同的結(jié)論。那么，在這2種方法中哪一種方法測(cè)定的內(nèi)源性氨基酸排泄量更穩(wěn)定?2種方法測(cè)值的絕對(duì)差值有多少?其引起飼料氨基酸真消化率的變化程度如何?這些問題的探討對(duì)飼料氨基酸真消化率測(cè)定中內(nèi)源性氨基酸排泄量的準(zhǔn)確測(cè)定非常重要。為此，本研究以黃羽肉雞為試驗(yàn)對(duì)象，通過分析絕食和飼喂無氮飼糧條件下內(nèi)源性氨基酸排泄量及其變異的情況，為雞飼料可利用氨基酸評(píng)定中內(nèi)源性氨基酸測(cè)定方法的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及管理

采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選擇健康、體重(平均2.8 kg)基本一致的18周齡黃羽肉公雞(廣西土雞2號(hào))72只，隨機(jī)分成3組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只雞，分4個(gè)批次重復(fù)測(cè)定絕食、強(qiáng)飼25 g無氮飼糧、強(qiáng)飼40 g無氮飼糧條件下的內(nèi)源性氨基酸排泄量。每批次代謝試驗(yàn)完成后，試驗(yàn)雞進(jìn)入14 d的恢復(fù)期。代謝試驗(yàn)在廣東溫氏食品有限公司肉雞試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)雞單籠飼養(yǎng)于代謝籠中，飼養(yǎng)管理按動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)程序進(jìn)行。代謝室的溫度維持在25℃，每日光照12 h。

1.2 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)雞恢復(fù)期試驗(yàn)飼糧為玉米-豆粕型商品飼糧(代謝能12.13 MJ/kg，粗蛋白質(zhì)17.05%，溫氏集團(tuán)食品有限公司生產(chǎn))，無氮飼糧由玉米淀粉(粗蛋白質(zhì)0.30%)與1%預(yù)混料混合而成。玉米淀粉來源于玉米的加工產(chǎn)物，由秦皇島驪驊淀粉股份有限公司生產(chǎn)，預(yù)混料組成同恢復(fù)期試驗(yàn)飼糧中預(yù)混料。

1.3 代謝試驗(yàn)法測(cè)定內(nèi)源性氨基酸排泄量

雞內(nèi)源性氨基酸排泄量測(cè)定過程參照Sibbald[1，4]代謝試驗(yàn)法進(jìn)行，具體過程如表 1 所示。

表1 雞內(nèi)源性氨基酸排泄量的測(cè)定程序Table1 Procedure of determining endogenous amino acid excretion in chickens

排泄物的收集技術(shù)參照GB/T 26437—2010[11]的方法進(jìn)行，每次待集糞袋中的排泄物超過糞袋容積的1/4時(shí)，將排泄物無損失地轉(zhuǎn)入相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿中，待每只試驗(yàn)雞完成48 h的收集期后，將全部糞樣轉(zhuǎn)入65℃烘箱中鼓風(fēng)干燥。烘干樣在天平室回潮24 h后稱重，粉碎過40目篩制成風(fēng)干樣品。飼料和糞樣的氨基酸含量用日立L-8500A氨基酸分析儀測(cè)定，同時(shí)測(cè)定樣品的干物質(zhì)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

絕食法與無氮飼糧法測(cè)定黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸排泄量的變異系數(shù)按下列公式計(jì)算:

式中:Yij為第i個(gè)批次的第j個(gè)觀測(cè)值;ˉYi為第i個(gè)批次的均值;ˉY為樣本總均值;G為組數(shù);N為樣本總數(shù);Ni為第i個(gè)組樣本量。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析按照單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，利用SAS 9.0中的PROC ANOVA模塊對(duì)絕食條件下黃羽肉雞的內(nèi)源性氨基酸排泄量、無氮飼糧條件下內(nèi)源性氨基酸排泄量數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，其統(tǒng)計(jì)模型為:

式中:μ 為總平均值;αi為組間效應(yīng);εij為隨機(jī)誤差。平均值間差異的顯著性采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 絕食法與無氮飼糧法測(cè)定黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸排泄量的比較

從絕食組、25 g無氮飼糧組、40 g無氮飼糧組內(nèi)源性氨基酸排泄量的變異看(表2)，3個(gè)組17種內(nèi)源性氨基酸排泄量平均變異系數(shù)分別為13.5%、21.4%、22.2%，絕食組內(nèi)源性氨基酸排泄量的平均變異系數(shù)低于無氮飼糧組。在總氨基酸(17種)的排泄量上，絕食組、25 g無氮飼糧組、40 g無氮飼糧組內(nèi)源性氨基酸排泄量依次顯著增加(P＜0.05)，其中25 g無氮飼糧組的總氨基酸排泄量為絕食組的1.32倍，40 g無氮飼糧組的總氨基酸排泄量為絕食組的1.58倍。17種氨基酸中有8種氨基酸(蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、纈氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸)的內(nèi)源性排泄量在強(qiáng)飼40 g無氮飼糧、強(qiáng)飼25 g無氮飼糧和絕食條件下依次顯著降低(P＜0.05)，6種氨基酸(蛋氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)的內(nèi)源性排泄量在強(qiáng)飼25和40 g無氮飼糧條件下差異不顯著(P＞0.05)，但都顯著高于絕食條件下的相應(yīng)值(P＜0.05);3種氨基酸(胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸)的內(nèi)源性排泄量在絕食條件下和強(qiáng)飼25 g無氮飼糧條件下差異不顯著(P＞0.05)，但都顯著低于強(qiáng)飼40 g無氮飼糧條件下的相應(yīng)值(P＜0.05)。

2.2 絕食條件下黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸排泄量的變異

絕食條件下，從4個(gè)批次黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸的含量及排泄量的變異看(表3)，內(nèi)源性17種氨基酸含量的總變異系數(shù)在10.90% ～21.74%，其中批內(nèi)變異系數(shù)在9.53% ～18.47%，批間變異系數(shù)在5.62% ～18.57%，這表明批內(nèi)變異與批間變異比較接近。4個(gè)測(cè)定批次間，內(nèi)源性14種氨基酸(賴氨酸、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、總氨基酸)的含量存在顯著性差異(P＜0.05)。從絕食48 h內(nèi)源性氨基酸的排泄量看，黃羽肉雞17種內(nèi)源性氨基酸排泄量的總變異系數(shù)在9.74%～19.99%，其中批內(nèi)變異系數(shù)在9.97%～16.88%，批間變異系數(shù)在2.58%～16.23%，表明批內(nèi)變異系數(shù)大于批間變異系數(shù)。4個(gè)測(cè)試批次間，內(nèi)源性蘇氨酸、胱氨酸、絲氨酸、脯氨酸的排泄量差異顯著(P＜0.05)，其他13種氨基酸的排泄量批間差異不顯著(P＞0.05)。由于4個(gè)批次間內(nèi)源性氨基酸48 h的排泄量在6.09～6.70 g/只 變 異，差 異 不 顯 著 (P ＞0.05)[12]，本試驗(yàn)4個(gè)測(cè)定批次的內(nèi)源性大多數(shù)氨基酸的含量存在顯著性差異(P＜0.05)，而內(nèi)源性氨基酸的排泄量上僅出現(xiàn)4種氨基酸的內(nèi)源排泄量呈批次間的顯著性差異(P＜0.05)，這表明，批次內(nèi)重復(fù)間內(nèi)源糞重與其氨基酸含量的乘積所累積的變異所占權(quán)重大大超過了批次間內(nèi)源性氨基酸排泄量的變異。從17種內(nèi)源性氨基酸48 h的平均排泄量看，蛋氨酸和組氨酸的平均排泄量在5～10 mg/只，異亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸的平均排泄量在10～20 mg/只，賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸、丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸的平均排泄量在20～30 mg/只，胱氨酸、天冬氨酸的平均排泄量在30～40 mg/只，谷氨酸、甘氨酸的平均排泄量在40～60 mg/只。

2.3 無氮飼糧條件下黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸排泄量的變異

強(qiáng)飼25 g無氮飼糧條件下，從4個(gè)批次黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸的含量及排泄量的變異看(表4)，內(nèi)源性17種氨基酸含量的總變異系數(shù)在10.66%～27.13%，其中批內(nèi)變異系數(shù)在7.93%～25.94%，批間變異系數(shù)在2.78% ～13.25%，這表明糞樣中氨基酸含量的批內(nèi)變異遠(yuǎn)大于批間變異。4個(gè)測(cè)定批次間，內(nèi)源性胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸含量存在顯著性差異(P＜0.05)。黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸48 h排泄量的總變異系數(shù)在17.77%～31.33%，其中批內(nèi)變異系數(shù)在14.99%～28.80%，批間變異系數(shù)在3.89% ～17.04%，這表明批內(nèi)變異大于批間變異。4個(gè)測(cè)定批次間，內(nèi)源性精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸的排泄量存在顯著性差異(P＜0.05)。由于4個(gè)批次間內(nèi)源性氨基酸48 h的排泄量在5.74～6.07 g/只變異，差異不顯著(P ＞ 0.05)[12]，本試驗(yàn)4個(gè)測(cè)定批次的內(nèi)源性胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸的含量存在顯著性差異(P＜0.05)，相應(yīng)的精氨酸、胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸4種氨基酸的內(nèi)源性排泄量呈批次間的顯著性差異(P＜0.05)，這表明，批次間內(nèi)源性氨基酸含量的變異對(duì)內(nèi)源性氨基酸排泄量變異影響較大。從17種內(nèi)源性氨基酸48 h的平均排泄量看，蛋氨酸、組氨酸的平均排泄量在8～10 mg/只，異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、絲氨酸、脯氨酸的平均排泄量在20～30 mg/只，蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、胱氨酸的平均排泄量在30～40 mg/只，谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸的平均排泄量在50～75 mg/只。

表2 絕食法與無氮飼糧法測(cè)定試驗(yàn)雞內(nèi)源性氨基酸排泄量的比較Table2 Comparison of endogenous amino acid excretion of chickens using fasting method and NFD method

強(qiáng)飼40 g無氮飼糧條件下，從4個(gè)批次黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸的含量及排泄量的變異看(表5)，內(nèi)源性17種氨基酸含量的總變異系數(shù)在15.40%～34.21%，其中批內(nèi)變異系數(shù)在16.75%～34.73%，批間變異系數(shù)在1.60% ～14.55%，這表明批內(nèi)變異遠(yuǎn)大于批間變異。4個(gè)測(cè)定批次間，內(nèi)源性17種氨基酸及總氨基酸含量均不存在顯著性差異(P＞0.05)。黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸48 h排泄量的總變異系數(shù)在16.23%～33.39%，其中批內(nèi)變異系數(shù)在17.15% ～33.82%，批間變異系數(shù)在4.19% ～16.29%，這表明黃羽肉雞內(nèi)源性氨基酸排泄量的批內(nèi)變異大于批間變異。4個(gè)測(cè)定批次間，內(nèi)源性異亮氨酸、苯丙氨酸的排泄量存在顯著性差異(P＜0.05)。從17種內(nèi)源性氨基酸48 h的平均排泄量看，蛋氨酸、組氨酸的平均排泄量在10～20 mg/只，異亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的平均排泄量在20～30 mg/只，賴氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、絲氨酸、脯氨酸的平均排泄量在30～40 mg/只，纈氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸的平均排泄量在40～90 mg/只。

3 討論

3.1 絕食法和無氮飼糧法測(cè)定內(nèi)源性氨基酸排泄量的差異

本研究中，絕食法和無氮飼糧法測(cè)得17種內(nèi)源性氨基酸中谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸的排泄量均較高。這是由于內(nèi)源性氨基酸主要來源于黏液、胰液、腸液、膽汁，這些成分中黏蛋白含天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸較高，胰液和小腸液中天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸的含量較高，而膽汁中甘氨酸是主要氨基酸[13]。在絕食條件下，除胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸的內(nèi)源性損失與強(qiáng)飼25 g無氮飼糧條件下差異不顯著外，其他14種氨基酸內(nèi)源性損失均顯著低于25或40 g無氮飼糧組的相應(yīng)值。同時(shí)40 g無氮飼糧組蘇氨酸、組氨酸、精氨酸、纈氨酸、胱氨酸的內(nèi)源性損失高于25 g無氮飼糧組，表明干物質(zhì)采食量影響內(nèi)源性氨基酸排泄量。本研究測(cè)得黃羽肉雞在25 g無氮飼糧組內(nèi)源性氨基酸48 h排泄量為555.3 mg/只，比絕食組高 133.4 mg/只，40 g無氮飼糧組48 h內(nèi)源性氨基酸排泄量比絕食組高245.1 mg/只。國內(nèi)外許多研究也表明，絕食條件下雞內(nèi)源性氨基酸排泄量顯著低于無氮飼糧條件下的相應(yīng)值(表6)，但不同研究者所得結(jié)果存在一定差異，表明雞內(nèi)源性氨基酸的排泄量本身存在較大的變異。Sibbald[2]指出雞內(nèi)源性氨基酸損失隨試驗(yàn)雞體重的增加而增加。Adedokun等[15]發(fā)現(xiàn)5日齡艾維茵肉雞內(nèi)源性氨基酸排泄量約為15或21日齡時(shí)的2倍。此外，試驗(yàn)雞的品種、環(huán)境溫度、排泄物收集時(shí)間、無氮飼糧組成及強(qiáng)飼量等因素也會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性氨基酸測(cè)值的差異。

在絕食法與無氮飼糧法測(cè)定內(nèi)源性氨基酸排泄量的差異來源上，無氮飼糧可刺激腸道細(xì)胞的分泌以及磨損消化道壁，從而導(dǎo)致內(nèi)源性氨基酸的排泄量不僅比絕食法測(cè)值高，而且還隨強(qiáng)飼量的增加而增加，這是目前通常選用無氮飼糧估測(cè)待測(cè)飼料條件下其內(nèi)源性氨基酸排泄量的理論依據(jù)。然而，在本試驗(yàn)中，多批次測(cè)定絕食、強(qiáng)飼25 g無氮飼糧、強(qiáng)飼40 g無氮飼糧條件下17種內(nèi)源性氨基酸排泄量分別為421.9、555.3和667.0 mg/只，按照強(qiáng)飼量為40～50 g(飼糧蛋白質(zhì)水平約為20%)，氨基酸的總攝入量約為8 000 mg推算，內(nèi)源性氨基酸排泄量對(duì)氨基酸消化率的貢獻(xiàn)分別為5.3%、6.9%、8.3%。絕食法與無氮飼糧法引起的飼料氨基酸消化率的差異可達(dá)3%。40 g無氮飼糧組與25 g無氮飼糧組引起的飼料氨基酸消化率的差異達(dá)1.4%。

3.2 內(nèi)源性氨基酸測(cè)定的變異對(duì)飼料氨基酸真消化率測(cè)定的影響

在內(nèi)源性氨基酸測(cè)定的變異上，目前尚鮮見關(guān)于其批次間變異的相關(guān)報(bào)道。而在生物學(xué)法測(cè)定雞飼料代謝能值的變異上，Bourdillon等[16]報(bào)道，歐洲7個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用自由采食-全收糞法測(cè)定4個(gè)肉仔雞飼糧的氮校正表觀代謝能(AMEn)的再現(xiàn)性的變異系數(shù)為2.92%。這一變異系數(shù)高于干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪的重現(xiàn)性變異系數(shù)，但低于粗灰分和粗纖維的重現(xiàn)性變異系數(shù)。在本試驗(yàn)測(cè)定的同時(shí)，已得出黃羽肉雞玉米淀粉飼糧強(qiáng)飼量為25 g時(shí)，4個(gè)測(cè)定批次的真代謝能(TME)變異系數(shù)為1.60%。當(dāng)玉米淀粉飼糧強(qiáng)飼量為40 g時(shí)，4個(gè)測(cè)定批次的TME的變異系數(shù)為4.65%[12]。本試驗(yàn)中，絕食組、25 g無氮飼糧組、40 g無氮飼糧組內(nèi)源性氨基酸排泄量的總變異系數(shù)分別為 9.74% ～19.99%、17.77% ～31.33%、16.23% ～33.39%。其總變異系數(shù)、批內(nèi)變異系數(shù)、批間變異系數(shù)均大大高于代謝能值的變異系數(shù)，這可能與內(nèi)源性氨基酸排泄量(每48 h 0.4～0.6 g)比較低，而且雞個(gè)體間在內(nèi)源性氨基酸排泄量上差異比較大有關(guān)。

在飼糧強(qiáng)飼量為40～50 g(飼糧蛋白質(zhì)水平約為20%)，氨基酸的總攝入量約為8 000 mg的前提下，絕食組4個(gè)測(cè)定批次間內(nèi)源性氨基酸排泄量最大相差63.3 mg，25 g無氮飼糧組4個(gè)測(cè)定批次間的內(nèi)源氨基酸排泄量最大相差119.0 mg，40 g無氮飼糧組4個(gè)測(cè)定批次間的氨基酸排泄量最大相差110.4 mg，則絕食組、25 g無氮飼糧組、40 g無氮飼糧組的重復(fù)測(cè)定批次間的差異引起氨基酸消化率的差異分別為0.8%、1.5%和1.4%，表明采用絕食法所測(cè)內(nèi)源性氨基酸損失對(duì)飼料氨基酸消化率測(cè)定結(jié)果的干擾相對(duì)較小。

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表6 試驗(yàn)雞內(nèi)源性氨基酸排泄量的比較Table6 Comparison of endogenous amino acid excretion of chickens

4 結(jié)論

①絕食組、25 g無氮飼糧組、40 g無氮飼糧組內(nèi)源性氨基酸排泄量依次增加，3個(gè)組內(nèi)源性氨基酸排泄量總變異系數(shù)均較大，批內(nèi)變異系數(shù)均大于批間變異系數(shù)。

②采用絕食法測(cè)定的內(nèi)源性氨基酸排泄量對(duì)飼料氨基酸真消化率測(cè)定結(jié)果的干擾小于無氮飼糧法。

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