乙型肝炎肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞Toll樣受體4的變化*

閻雙緩 陳翠英 王素平 唐亞芳 宋海燕 耿建章 王曉靜 高朋彬

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是連接天然免疫及獲得性免疫系統(tǒng)的重要橋梁[1、2]，其中TLR4主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞上，它識(shí)別病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）而引起機(jī)體特異性免疫反應(yīng)。TLR4在乙型肝炎中的作用機(jī)制復(fù)雜，其特異的模式識(shí)別方式和相互調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)參與了慢性HBV感染的發(fā)病，同時(shí)具有抗HBV復(fù)制的作用[3、4]。但TLR4在慢性HBV感染的發(fā)生、慢性化、重型化，以及肝癌的發(fā)生中的確切作用和具體機(jī)制尚不清楚。本研究觀察了乙型肝炎肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞表面TLR4受體表達(dá)水平。

資料與方法

一、研究對(duì)象 收集2010年2月至2011年2月我院門(mén)診及住院的慢性HBV感染者70例，其中慢性HBV攜帶者30例（男性19例，女性11例，平均年齡40±10歲），乙型肝炎肝硬化患者40例（男性30例，女性10例，平均年齡52±8歲，Child-Pugh A級(jí)15例，B級(jí)13例，C級(jí)12例）。符合2000年西安會(huì)議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。另選健康對(duì)照人群30例，男性18例，女性12例，平均年齡31±11歲。排除HAV、HCV、HDV、HEV 或HIV合并感染及肝癌患者，近3個(gè)月內(nèi)未用過(guò)抗病毒藥物及糖皮質(zhì)激素等影響免疫功能的藥物。

二、外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4檢測(cè) 使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，取EDTA抗凝血細(xì)胞懸液100μl，分別加入APC-抗-CD14單克隆抗體 10μl和 PE-抗 -TLR4單克隆抗體10μl，室溫放置30min，加入紅細(xì)胞裂解液2ml，避光靜置15min，離心，加1ml PBS震蕩洗滌2次，設(shè)置不加抗體陰性對(duì)照。離心棄去保存液，所得細(xì)胞以PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)至2×109/L，將標(biāo)本置于流式細(xì)胞儀上，以APC-抗-CD14陽(yáng)性設(shè)門(mén)，共獲取門(mén)內(nèi)10000個(gè)單個(gè)核細(xì)胞。經(jīng)Cellquest統(tǒng)計(jì)軟件分析，獲取直方圖，以平均免疫熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）表示 TLR4 的表達(dá)強(qiáng)度。

三、血清白細(xì)胞介素6（IL-6）水平檢測(cè) 采用ELISA法。無(wú)菌采集靜脈血5ml，常規(guī)離心后取血清，-80℃冰箱保存，待測(cè)。ELISA試劑盒為晶美生物有限公司分裝的美國(guó)Genzyme公司產(chǎn)品。

結(jié)果

一、外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)和血清IL-6水平 乙型肝炎肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)和血清IL-6水平比正常對(duì)照人群明顯升高（P＜0.01）；慢性HBV攜帶者與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4水平無(wú)明顯差異（P＞0.05）；慢性HBV攜帶者血清IL-6水平高于正常人（P＜0.01，表1）。乙型肝炎肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4水平與血清IL-6水平呈顯著性正相關(guān)（γ＝0.768，P=0.0078），而HBV攜帶者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)與血清IL-6水平無(wú)顯著性相關(guān)（γq＝-0.775，P＝0.375）。

表1 各組人群外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)和血清IL-6水平（）

表1 各組人群外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)和血清IL-6水平（）

與正常組比，①P＜0.01

組別 例數(shù) TLR4（MFI） IL-6（ng/L）正常人 30 3.2±2.1 15.6±5.6 HBV 攜帶者 30 3.8±1.8 45.6±36.8①肝硬化 40 13.5±4.6① 80.5±36.5①

二、肝功能不同分級(jí)乙型肝炎肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)與血清IL-6水平比較 從Child A級(jí)、Child B級(jí)到Child C級(jí)，患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)與血清IL-6水平依次升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4和血清IL-6水平（）

表2 肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4和血清IL-6水平（）

與 Child A 組比，①P＜0.05，②P＜0.01；與 Child B 組比，③P＜0.05，④P＜0.01

例數(shù) TLR4（MFI） IL-6（ng/L）Child A 15 7.9±5.5 29.68±17.85 Child B 13 11.8±4.8① 57.37±28.55②Child C 12 16.5±7.6①③ 95.98±30.58②④

討論

TLR4的識(shí)別譜廣，生物學(xué)作用廣泛，主要包括調(diào)控獲得性免疫反應(yīng)和引發(fā)炎癥反應(yīng)等。TLR4表達(dá)于細(xì)胞表面，能直接識(shí)別病毒蛋白顆粒，不但具有促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放、促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟、分化和功能發(fā)揮等作用，還在調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)入侵病原體的免疫應(yīng)答水平及抗病毒方面有不容忽視的作用[6]。Mozer-Lisewska等[7]在HBV感染兒童患者肝組織發(fā)現(xiàn)TLR4的表達(dá)，而正常肝組織則無(wú)表達(dá)。也有報(bào)道TLR4在慢性乙型肝炎肝組織存在高表達(dá)，提示TLR4在乙型肝炎發(fā)病中的作用是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。

我們的研究結(jié)果表明，在乙型肝炎肝硬化患者存在外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4的過(guò)度表達(dá)，且外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血清IL-6水平存在密切關(guān)系。目前，關(guān)于TLR4表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究還比較少。Manigol等[8]認(rèn)為肝硬化患者內(nèi)毒素可致TLR4表達(dá)變化，內(nèi)毒素是TLR4最重要的配體，體內(nèi)內(nèi)毒素等刺激信號(hào)以及高水平IL-6可導(dǎo)致外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)增高[9]。慢性肝炎患者由于腸道菌群紊亂和細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)以及胃腸道黏膜淤血，使腸道產(chǎn)生、吸收內(nèi)毒素增加，同時(shí)由于肝細(xì)胞大量壞死，免疫功能下降，枯否細(xì)胞清除能力下降，因而對(duì)內(nèi)毒素及內(nèi)毒素免疫復(fù)合物的清除減少，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥[10]。內(nèi)毒素、凋亡細(xì)胞等TLR4刺激信號(hào)，有可能導(dǎo)致外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)上述刺激信號(hào)產(chǎn)生過(guò)度反應(yīng)[11]。IL-6可以通過(guò)多種信號(hào)通路導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡和壞死，血清IL-6水平與慢性肝病病情進(jìn)展有關(guān)，與肝臟病變程度也相關(guān)[12，13]。

乙型肝炎肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)與血清IL-6水平隨著Child分級(jí)的逐漸升高而相應(yīng)增加，表明TLR4表達(dá)及IL-6水平隨著肝功能受損程度的加重而增加，它可能參與了乙型肝炎肝硬化的發(fā)病及病理發(fā)展過(guò)程。乙型肝炎肝硬化患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血清IL-6水平呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，IL-6可能上調(diào)單個(gè)核細(xì)胞TLR4的表達(dá)，而單個(gè)核細(xì)胞TLR4的表達(dá)上調(diào)又有可能導(dǎo)致單個(gè)核細(xì)胞IL-6的表達(dá)增加，兩者之間可以相互影響，從而在乙型肝炎肝硬化的發(fā)病過(guò)程中共同發(fā)揮一定的作用。

研究亦發(fā)現(xiàn)，慢性HBV攜帶者與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4水平無(wú)明顯差異，HBV攜帶者血清IL-6水平高于正常人。田華[14]的研究結(jié)果表明，慢性HBV攜帶者血清IL-6水平高于正常人，慢性乙型肝炎患者血清IL-6水平高于HBV攜帶者，表明血清IL-6水平與病毒復(fù)制有關(guān)，更與肝細(xì)胞受損的程度有關(guān)。慢性HBV攜帶者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)與血清IL-6水平無(wú)顯著相關(guān)，血清IL-6水平升高，但不足以誘發(fā)大量TLR4產(chǎn)生，故TLR4介導(dǎo)的肝損傷不明顯，這也可能是此類患者肝功能保持相對(duì)穩(wěn)定的原因。

可見(jiàn)，外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與肝硬化的發(fā)病及進(jìn)展有關(guān)。監(jiān)測(cè)TLR4的動(dòng)態(tài)變化有助于指導(dǎo)治療。在抗病毒治療基礎(chǔ)上，通過(guò)提高免疫、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境等措施，減少腸源性內(nèi)毒素的產(chǎn)生和吸收，減少TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)造成的免疫損傷，有可能延緩或減少肝硬化失代償和原發(fā)性肝癌的發(fā)生。

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