孔渝菡 秦新月 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

腦缺血后處理(IPC)是在腦缺血后再灌注初期通過各種物理或藥物方式實(shí)施的一種干預(yù)手段，是近年來發(fā)現(xiàn)的能減少缺血性腦損傷的方法，但其最佳實(shí)施策略及具體保護(hù)機(jī)制仍存在爭(zhēng)議〔1〕。本研究擬探討不同方式的缺血后處理對(duì)MCAO/再灌注大鼠缺血側(cè)IL-1β、IL-6表達(dá)的影響及軸突損傷情況，推測(cè)缺血后處理的可能機(jī)制。對(duì)于臨床上缺血性腦血管疾病的防治具有積極的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 成年健康SD大鼠，體重250～280 g，雌雄各半，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠25只，隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、缺血/再灌注組(I/R)、近端后處理組(IPC)、遠(yuǎn)隔后處理組(RIPC)、延遲后處理組(DIPC)，每組5只。選術(shù)后48 h為觀察時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物飼養(yǎng)及取材均遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

1.2 局灶性缺血再灌注模型制作 大鼠術(shù)前稱重，腹腔注射3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)，根據(jù)Longa等〔2〕報(bào)道的方法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注(MCAO)模型碘附消毒頸部皮膚，作頸部正中切口，暴露右側(cè)的頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，燒斷頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈的分支，并結(jié)扎燒斷頸外動(dòng)脈，用眼科剪在頸外動(dòng)脈殘端做一切口，將預(yù)先浸好石蠟的漁線從頸外動(dòng)脈切口緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，在漁線進(jìn)入約18～20 mm(從頸外動(dòng)脈分叉處算起)微感到阻力時(shí)，在頸外動(dòng)脈處結(jié)扎切口，完成右側(cè)MCA血流阻塞。再灌注方法為MCA血流阻塞2 h后將栓線退到頸總動(dòng)脈分叉處。

1.3 缺血后處理實(shí)施方案 分離大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，再灌注后立即夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，IPC組:同時(shí)阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈(bCCA)血流5 min，恢復(fù)5 min，如此進(jìn)行3次缺血/再灌注過程;RIPC組:分離并阻斷右下肢股動(dòng)脈血流5 min，恢復(fù)5 min，如此進(jìn)行3次缺血/再灌注循環(huán);DIPC組:阻斷bCCA血流5 min，恢復(fù)5 min，如此進(jìn)行3次缺血/再灌注循環(huán)。

1.4 組織學(xué)檢測(cè) 固定后的大鼠腦組織經(jīng)石蠟包埋后切片，于前囟后方2 mm處進(jìn)行連續(xù)冠狀切片(片厚4 μm)，按說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)法染色、DAB顯色并封片。在熒光顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞，每張免疫組化切片中采集5個(gè)具有代表性的高倍視野，通過Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量分析光密度值(OD)。

2 結(jié)果

2.1 不同方式缺血后處理后大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬的IL-1β、IL-6表達(dá) 在皮質(zhì)區(qū)，I/R組48 h后IL-1β、IL-6含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01)。IPC與RIPC組和 I/R組比較，IL-1β、IL-6含量顯著降低(P＜0.05)。DIPC組與I/R組比較差異不明顯。在海馬區(qū)缺血/再灌注48 h后大鼠海馬CA1～CA3區(qū)可見IL-1β、IL-6陽性細(xì)胞表達(dá)，除DIPC組外，其余后處理組與I/R組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1，圖1，圖2。

2.2 不同方式缺血后處理后大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬NF-200表達(dá) 腦缺血后神經(jīng)軸突發(fā)生壞死、形態(tài)紊亂，NF-200表達(dá)減少，在皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)軸突，I/R組NF-200光密度值顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)。IPC與RIPC組和I/R組比較，NF-200表達(dá)明顯增多(P＜0.01)。DIPC組與I/R組比較差異不明顯(P＞0.05)。在海馬缺血/再灌注48 h后大鼠海馬軸突可見明顯的NF-200表達(dá)，除DIPC組外，其余后處理組與I/R組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2，圖3。

表1 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬IL-1β光密度值、IL-6光密度值(± s，n=5)

表1 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬IL-1β光密度值、IL-6光密度值(± s，n=5)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與 I/R組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05，下表同

組別 IL-1β的光密度值皮質(zhì) 海馬IL-6的光密度值皮質(zhì) 海馬假手術(shù)組 0.13±0.026 0.14±0.021 0.23±0.034 0.24±0.031 I/R 0.42±0.0381) 0.34±0.0421) 0.58±0.0501) 0.50±0.0471)IPC 0.37±0.0301)3)0.29±0.0341)3)0.48±0.0481)2)0.43±0.0461)3)RIPC 0.35±0.0421)2)0.29±0.0461)3)0.49±0.0491)2)0.44±0.0531)3)DIPC 0.40±0.0411) 0.33±0.0301) 0.55±0.0791) 0.47±0.0441)

表2 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬NF-200光密度值表達(dá)(± s，n=5)

表2 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬NF-200光密度值表達(dá)(± s，n=5)

組別 皮質(zhì) 海馬假手術(shù)組0.54±0.051 0.54±0.069 I/R 0.20±0.0351) 0.17±0.0441)IPC 0.31±0.0841)2) 0.37±0.0471)2)RIPC 0.31±0.0441)2) 0.25±0.0491)3)DIPC 0.21±0.0451) 0.21±0.0321)

圖1 不同缺血后處理后缺血側(cè)皮質(zhì)IL-1β表達(dá)(DAB，×200)

圖2 不同缺血后處理后缺血側(cè)皮質(zhì)IL-6表達(dá)(DAB，×200)

圖3 缺血48 h后缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬的軸突(DAB，×200)

3 討論

炎癥、凋亡及細(xì)胞因子的上調(diào)在缺血性腦損傷中起著重要作用。IL-1β，IL-6作為炎癥因子的重要組成部分在一定程度上反映了炎癥的嚴(yán)重程度。IL-1β受促炎癥因子TNF-α誘發(fā)激活，并協(xié)同刺激IL-6產(chǎn)生，在缺血性腦損傷中增高，并產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)加重缺血局部的免疫炎癥反應(yīng)而加重神經(jīng)系統(tǒng)的損害〔3，4〕。本研究提示缺血后處理可能減少了腦缺血后出現(xiàn)的急性炎癥反應(yīng)這一重要病理過程從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。NF-200是神經(jīng)微絲與其他細(xì)胞骨架(微管等)的主要聯(lián)系體，它是一種與神經(jīng)元生長(zhǎng)、發(fā)育過程有關(guān)的蛋白，主要存在于神經(jīng)元軸突。腦缺血后神經(jīng)軸突發(fā)生壞死、形態(tài)紊亂，NF-200表達(dá)減少，當(dāng)神經(jīng)修復(fù)時(shí)由于神經(jīng)再生需要，神經(jīng)元在各種誘導(dǎo)因子作用下使NF合成增多，并通過軸漿運(yùn)輸?shù)捷S突，NF-200表達(dá)增加〔5〕。由此NF-200能反映腦損傷后神經(jīng)損傷和修復(fù)的程度。本研究顯示，通過缺血后處理的實(shí)施，各組大鼠腦組織中NF-200表達(dá)降低，提示幾種后處理方式均能不同程度地減輕腦缺血造成的神經(jīng)軸突損傷，保護(hù)軸突的完整進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)的再生和修復(fù)。

缺血后處理的方式可以是近缺血部位也可以是遠(yuǎn)隔部位的處理，且均能有效減少缺血部位的損傷，這為它的臨床應(yīng)用提供了良好的拓展空間。通過本研究，我們認(rèn)為5 min×3循環(huán)的近端和遠(yuǎn)隔部位后處理均能有效減少腦缺血再灌注損傷，這和以往報(bào)道缺血后處理具有器官保護(hù)作用的情況類似〔1〕。而1 d后的延遲后處理沒有起到明顯的腦保護(hù)作用，提示1 d后延遲保護(hù)時(shí)相可能已過〔6〕。綜上我們推論，早期進(jìn)行近端或遠(yuǎn)隔部位的缺血后處理能減少腦缺血再灌注后發(fā)生的炎癥反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)軸突，從而減小再灌注損傷，為神經(jīng)再生提供有利環(huán)境。

1 Zhao H.Ischemic postconditioning as a novel avenue to protect against brain injury after stroke〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2009;29:873-85.

2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20:84-91.

3 van der Pouw Kraan TC，Kasperkovitz PV，Verbeet N，et al.Genomics in the immune system〔J〕.Clin Immunol，2004;111:175-85.

4 Yang J，Ding JW，Chen LH，et al.Sequential expression of TLR4 and its effects on the myocardium of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕.Inflammation，2008;31:304-12.

5 Shaw G，Yang C，Ellis R，et al.Hyperphosphorylated neurofilament NF-H is a serum biomarker of axonal injury〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;336:1268-77.

6 Ren C，Gao X，Niu G，et al.Delayed postconditioning protects against focal ischemic brain injury in rats〔J〕.PLoS One，2008;3:e3851.