張麗霞，李凌智

(大慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 大慶 163712)

0 引言

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)屬于真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，非褐菌目，多孔菌科，褐臥孔菌屬[1]，主要生長(zhǎng)在俄羅斯北部，中國(guó)的黑龍江、吉林和日本北海道等寒冷地區(qū)[2]。多糖是樺褐孔菌重要的活性成分，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力和抗腫瘤活性等多種生物活性[3]。傳統(tǒng)提取多糖的方法有很多種，如熱水浸提法、堿液提取法[4]等。由于多糖成分大多為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，提取時(shí)大多需要進(jìn)行細(xì)胞破碎，而現(xiàn)有的機(jī)械和化學(xué)方法有時(shí)難以取得理想的破碎效果。并且傳統(tǒng)水浴浸提多糖存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低的缺點(diǎn)。目前，對(duì)樺褐孔菌多糖提取的研究還不夠深入，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)和探索。本文通過(guò)超聲波振蕩處理對(duì)樺褐孔菌多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為開(kāi)發(fā)和利用這種藥用真菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樺褐孔菌子實(shí)體，購(gòu)自吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)。

1.1.2 主要試劑

無(wú)水乙醇(黑龍江省雙城市鑫田化學(xué)試劑制造有限公司生產(chǎn))，95%乙醇(黑龍江省雙城市鑫田化學(xué)試劑制造有限公司生產(chǎn))，乙醚(沈陽(yáng)市華東試劑廠生產(chǎn))，苯酚(天津市巴斯夫化工有限公司生產(chǎn))，濃硫酸(黑龍江省阿城試劑廠生產(chǎn))，無(wú)水葡萄糖(中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn))。所有試劑均為市售分析純。

1.1.3 儀器

DHG-9245A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))，PDZ5-WS低速多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn))，755B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn))，NR-C26WF1冰箱(松下公司生產(chǎn))，HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn))，BS124S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司生產(chǎn))，通風(fēng)櫥(北京森雷博瑞實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取流程

樺褐孔菌粉末→ 超聲波振蕩預(yù)處理→ 恒溫水浴抽提2次→ 離心分離(4000rpm，15min)→取上清液并濃縮(至10ml)→醇沉過(guò)夜(40 ml 95%乙醇)→ 離心取沉淀 → 無(wú)水乙醇洗滌→ 乙醚洗滌 →離心(4000rpm，10min)→ 常規(guī)干燥多糖。

1.2.2 多糖提取率測(cè)定方法：采用苯酚-硫酸法[5]

1)原理。糖在濃硫酸的作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定。在波長(zhǎng)490 nm處和一定范圍內(nèi)其吸光度與多糖提取率呈線性關(guān)系正比。從而可以利用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測(cè)定樣品多糖的含量。

2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精確稱量葡萄糖于容量瓶中，混勻后定容。分別量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成一定的濃度梯度并置于干燥試管中，分別以蒸餾水補(bǔ)至相同的體積，再分別加入6%苯酚溶液0.5mL，搖勻。然后加濃硫酸2.5mL，充分搖勻，室溫放置20min，在490nm處測(cè)得其相應(yīng)的OD值。以糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪出葡萄糖微克數(shù)與OD值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和線性范圍。

3)樣品含量測(cè)定。準(zhǔn)確稱取樺褐孔菌多糖5 mg，蒸餾水溶解后定容于50 ml容量瓶中，吸取1.0 ml 樣品溶液，再依次加入0.5 ml 6%的苯酚溶液和2.5 ml濃硫酸，振蕩搖勻。沸水浴加熱15 min后冷卻至室溫，然后在490 nm處測(cè)吸光度，計(jì)算樣品溶液多糖的含量。

4)樣品多糖提取率的計(jì)算。多糖提取率(%)=(糖濃度×體積×稀釋倍數(shù)/樣品糖質(zhì)量)×100%。

1.2.3影響多糖提取率的因素

1)超聲波振蕩時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響。取5份菌粉，每份2g在超聲波破碎儀中處理時(shí)間分別為5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，提取溫度90℃，料液比1∶20條件下進(jìn)行樣品提取實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其多糖提取率。

2)提取溫度對(duì)多糖提取率的影響。取5份菌粉，每份2 g超聲振蕩時(shí)間均為20 min，在水提溫度分別為50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，料液比1∶20條件下進(jìn)行樣品提取實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其多糖提取率。

3)料液比對(duì)多糖提取率的影響。取5份菌粉，每份2g超聲振蕩時(shí)間均為20min，提取溫度均為90℃，在料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60的條件下進(jìn)行樣品提取實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定其多糖提取率。

1.2.4 多糖提取工藝的優(yōu)化

采用正交實(shí)驗(yàn)法：選用超聲時(shí)間(A)、提取溫度(B)、料液比(C) 三個(gè)因素，每個(gè)因素三個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

2.1 糖含量的測(cè)定結(jié)果

2.1.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

將配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液按照比例混合搖勻，放在沸水浴中煮沸15 min，冷卻至室溫后，以2.0 ml蒸餾水作為空白對(duì)照于490 nm處測(cè)各管的OD值。相同的步驟做三組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。繪出葡萄糖濃度與OD值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

曲線的繪制：y=4.7978×10x+4.18×10-2(R2=0.9976) 其中x為糖濃度，y為吸光度，R為相關(guān)系數(shù)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1超聲波振蕩時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

改變超聲波振蕩時(shí)間對(duì)多糖溶液提取率的影響如圖2所示。超聲時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：超聲時(shí)間對(duì)多糖溶液提取率的影響較大。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率曲線變化較規(guī)則，在振蕩時(shí)間5～15 min之間，提取率大幅增大，在15 min處達(dá)最大，之后緩慢減小。因此，振蕩時(shí)間15 min為最佳的工藝參數(shù)。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.2.2水浴浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響

改變水浴浸提溫度對(duì)多糖溶液提取率的影響如圖3所示。提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：提取溫度對(duì)多糖溶液提取率的影響也較大，隨著溫度的升高，提取率逐漸上升，當(dāng)溫度達(dá)到 70℃ 時(shí)為最大值；之后緩慢減小。因此，提取溫度70℃ 為最佳的工藝參數(shù)。

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.2.3料液比對(duì)多糖提取率的影響

改變料液比對(duì)多糖溶液提取率的影響如圖4所示。料液比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著溶劑量的增大，提取率逐漸上升，當(dāng)料液比達(dá)到1∶50時(shí)為最大值，之后減小。因此，料液比1∶50為最佳的工藝參數(shù)。

圖4 料液比對(duì)多糖提取率的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以超聲時(shí)間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)三個(gè)因素進(jìn)行樺褐孔菌多糖提取的正交實(shí)驗(yàn)。每個(gè)因素選取三個(gè)水平進(jìn)行L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析表

從極差分析可知：RA>RC> RB，所以影響多糖提取率的因素次序?yàn)锳 >C> B，即影響多糖提取率的主要因素是超聲時(shí)間，其次是提取溫度，影響最小的是料液比。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定較優(yōu)的提取條件為超聲時(shí)間20 min，料液比為1∶50，提取溫度60℃。在最佳工藝條件下實(shí)驗(yàn)所得多糖的提取率為5.03%，從方差分析表3中發(fā)現(xiàn)各因素均不顯著。

2.4 對(duì)比實(shí)驗(yàn)

在不進(jìn)行超聲振蕩處理的條件下，按照傳統(tǒng)的熱水浸提法對(duì)樺褐孔菌多糖進(jìn)行提取，所得的提取率為3.17%。而經(jīng)過(guò)超聲波振蕩處理，在最佳工藝條件下實(shí)驗(yàn)所得多糖的提取率為5.03%。如表4結(jié)果表明：通過(guò)超聲波振蕩處理能有效地提高樺褐孔菌多糖的提取率。

表4 對(duì)比試驗(yàn)

[參考文獻(xiàn)]

[1] 黃年來(lái).俄羅斯神秘的民間藥用真菌-樺褐孔菌[J].中國(guó)食用菌,2002,21(4):7-8.

[2] 金光,楊恩月,洪淳贊.樺褐孔菌多糖抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào),2004,27(4):257.

[3] MIZUNOT, ZHUANGC, ABEK, et al. Antium or and hypo-glycemic activities of polysaccharides from the scleritia and mycelia of Inonotus obliquus [J]. Int J Med Mushrooms,1999,1(4):301-316.

[4] YONGOOKKIM, SANG BAEHAND, HONGWOEN LEE, et al. Immune-stimulating effect of the endo-polysaccharide produced by submerged culture of Inonotus obliquus [J].Life Sciences,2005,77:2438-2456.

[5] 孫素蘭,俞勵(lì)平,葉青山.超聲波法提取靈芝袋泡茶多糖的實(shí)驗(yàn)研究[J].食品與藥品,2006,8(1):52-54.

[6] Zhang L X, Fan C, .Chemical composition and antitumor activity of alkali-extracted polysaccharide from Inonotus obliquus[J]. Journal of Medicinal Plants Research,2011,5(7):1251-1260.